河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心

張 闖 田 偉 王 相 牛麗穎(石家莊 050091)

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方 藥 研 究

HPLC法同時測定蛇床子配方顆粒中蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素的含量研究*

河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心

張 闖 田 偉 王 相 牛麗穎(石家莊 050091)

目的：通過對蛇床子配方顆粒的定性鑒別和定量分析研究，制定更加完善的蛇床子配方顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 方法：以蛇床子配方顆粒為對照品，采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定蛇床子配方顆粒中蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素3種成分的含量。 結(jié)果：含量測定中，以測定的峰面積為縱坐標(biāo)，蛇床子素在 0.04 ～0.40 μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系( r2= 0.993)； 花椒毒酚在 0.04 ～ 0.40 μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系( r2= 0.994)；花椒毒素在0.04 ～ 0.40 μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系( r2= 0.996)；線性關(guān)系良好；平均回收率分別為99.53%、98.13%和101.46% (n= 6)，準(zhǔn)確度良好。結(jié)論：本方法重復(fù)性良好，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，完善和提高了蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

蛇床子配方顆粒；高效液相色譜法；控制質(zhì)量；蛇床子素；花椒毒酚；花椒毒素；指紋圖譜

蛇床子Cnidiummonnieri(L.) Cuss. 是傘形科植物蛇床的成熟果實，經(jīng)過自然風(fēng)干后制得的藥物，具有溫腎壯陽、殺蟲止癢以及燥濕祛風(fēng)的功效。根據(jù)中醫(yī)古籍記載，臨床上腎虛陽痿、濕痹腰痛、陰癢帶下、濕疹瘙癢、宮冷不孕的治療可以應(yīng)用蛇床子進行治療。外用時，控制劑量，多煎湯熏洗，或研末調(diào)敷。[1-3]蛇床子主要的藥效成分為蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異茴芹素等香豆素類化合物，[4]如圖1。由于這些化合物同屬香豆素類，在結(jié)構(gòu)上具有相似之處，因此再對中藥蛇床子進行有效成分的定性分析和定量分析都有一定的難度。

蛇床子配方顆粒是蛇床子經(jīng)過提取、分離、提純、濃縮、干燥和制粒等現(xiàn)代中藥制藥技術(shù)加工所得，其療效已經(jīng)得到臨床驗證。目前，中藥配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有一個全國性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)所有生產(chǎn)中藥配方顆粒的企業(yè)，都應(yīng)用企業(yè)內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)對其生產(chǎn)的中藥配方顆粒進行質(zhì)量控制。針對這種情況，國家食品藥品監(jiān)管總局在2015 年12 月發(fā)布了《中藥配方顆粒管理辦法(征求意見稿)》，在這個《管理辦法(征求意見稿)》中，明確要求各中藥配方顆粒生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的中藥配方顆粒，應(yīng)體現(xiàn)多成分和整體質(zhì)量控制。藥典中，蛇床子的檢測鑒定只針對蛇床子素單一指標(biāo)進行定性和定量鑒別，所以蛇床子配方顆粒的生產(chǎn)企業(yè)也僅僅對蛇床子素單一成分進行鑒別和含量測定，因此進一步完善和提高蛇床子配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很有意義。本研究按照 2015 版《中國藥典》一部的方法，并參考相關(guān)的文獻，[5-7]采用高效液相色譜(HPLC)法能夠同時測定蛇床子配方顆粒中蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素 3 種香豆素類成分的含量。同時，筆者還比較了同一廠家，不同生產(chǎn)批次的蛇床子配方顆粒樣品中這3種香豆素類成分的含量差異，并建立了蛇床子配方顆粒HPLC的指紋圖譜，通過計算各批蛇床子配方顆粒相似度，能夠?qū)ι叽沧优浞筋w粒進行綜合質(zhì)量評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Waters e2695 HPLC儀，Waters 2489型紫外檢測器，Waters高效液相色譜LC工作站；電子分析天平:ME204E/02(梅特勒-托利多)，Milli-Q超純水機，乙腈為色譜純，水為超純水，實驗中其他試劑均為分析純。

1.2 試藥 實驗中所用的蛇床子素對照品，購自中國食品藥品檢定研究院( 批號: 110822-201308)；花椒毒素和花椒毒酚對照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，花椒毒酚批號：16090904、花椒毒素批號：151019；蛇床子配方顆粒(批號：15022711、15032811、15031411)由石家莊神威藥業(yè)集團有限公司提供。

圖1 蛇床子中含有的主要香豆素類成分

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 將對照品蛇床子素、花椒毒素和花椒毒酚在80℃條件下干燥至恒重，3種對照品均精密稱取2 mg，分別放置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解至容量瓶刻度，超聲30 min，即得蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備 取在 80℃ 條件下干燥至恒重的供試品蛇床子配方顆粒(批號：15022711)粉末約0.1 g，精密稱定，將其加入至具塞錐形瓶中，隨后精密加入甲醇溶劑25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷至室溫；再次稱定重量，將減少的重量補足，搖勻，取大小合適的濾紙過濾，即得蛇床子配方顆粒的供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱，XBridge C18 柱 ( 4.6×250 mm, 5 μm)；流動相：乙腈(A) - 0. 1% 醋酸水(B)；流速，1 mL/min；梯度洗脫程序為：0 ～ 15 min，23% ～ 45% A；15 ～ 30 min，45% ～ 100% A；30 ～ 45 min，100% A；檢測波長，322 nm；柱溫，40℃；理論板數(shù)按蛇床子素峰計算應(yīng)不低于3 000。其HPLC色譜圖見圖2。

注：1為花椒毒酚，2為花椒毒素，3為蛇床子素

2.4 線性關(guān)系 分別精密吸取3種香豆素對照品溶液 2、6、10、15、20 μL，按 “2.3” 項色譜條件測定這3種香豆素類成分的線性關(guān)系。以測定的蛇床子素的峰面積作為縱坐標(biāo)，蛇床子素的進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，蛇床子素在0.04 ～ 0.40 μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，回歸方程為：Y =82 075X-58 477，r2= 0.993；以測定的花椒毒酚的峰面積為縱坐標(biāo)，花椒毒酚的進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，花椒毒酚在0.04 ～ 0.40 μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，回歸方程為：Y =44 397X-32 648，r2= 0.994；以測定的花椒毒素的峰面積作為縱坐標(biāo)，花椒毒素的進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，花椒毒素在0.04 ～ 0.40 μg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，回歸方程為：Y =38 486X-28 028，r2= 0.996；蛇床子素、花椒毒素和花椒毒酚3種對照品的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度 精密吸取蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素對照品溶液10 μL，依照“2.3”項所述色譜條件連續(xù)進樣6次，蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素色譜峰面積RSD值分別為 0.48 %、0.34%和1.94%，結(jié)果均小于2%，說明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取干燥處理的供試品蛇床子配方顆粒(批號：15022711)約0.1 g，室溫放置，按上述供試品溶液的制備方法制備該批次蛇床子配方顆粒供試品溶液。分別在0、2、4、6、8、10、12、18 h ，精密吸取蛇床子配方顆粒供試品溶液10 μL，按“2.3”項所述色譜條件分別進樣測定，最后根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，計算蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素峰面積RSD值分別為0.71 %、1.97%和0.58% (n=8) ，小于2% ，結(jié)果表明蛇床子配方顆粒供試品溶液在 18 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性考察 分別精密稱取干燥處理的同一批蛇床子配方顆粒樣品( 批號：15022711) 6份，每份約0.1 g，室溫放置，按供試品溶液制備方法制備，精密吸取10 μL，依照 “2.3”項所述色譜條件進樣，記錄峰面積，計算含量。最后根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，計算得供試品溶液蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素含量RSD值分別為1.72 %、1.71%和1.93% (n=6) 小于2% ，結(jié)果表明樣品測定重復(fù)性良好。

2.8 準(zhǔn)確度考察 參考《中國藥典》和其他相關(guān)文獻，作者決定采用加樣回收法對蛇床子配方顆粒樣品準(zhǔn)確度進行考察。取同一批樣品(批號：15022711)6份，每份約0.05 g，精密稱定，室溫放置。精密加入一定量蛇床子素對照品、花椒毒酚對照品和花椒毒素對照品，按供上述供試品溶液制備方法制備，依“2.3”色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量。根據(jù)實驗結(jié)果，3種香豆素類對照品的平均回收率分別為99.53%、98.13%和101.46%(n=6)。

2.9 3批樣品含量測定 采用上述色譜方法，記錄峰面積，計算含量。對本品3批樣品中的蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素含量進行測定，結(jié)果詳見表1。

表1 3批樣品中的蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素含量結(jié)果

序號批號蛇床子素(mg/g)花椒毒酚(mg/g)花椒毒素(mg/g)1150227116 217 842 512150328116 248 572 483150314116 618 592 63

3 討論

中藥蛇床子具有多種藥理作用：有抗心律失常、擴張血管、降低血壓、保護心血管等心血管方面的藥效作用；有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、促進小鼠學(xué)習(xí)和記憶等中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的藥效作用；有降血脂、促進成骨細(xì)胞增殖、分化等內(nèi)分泌系統(tǒng)方面的藥效作用；有殺精作用和性激素樣生殖系統(tǒng)方面的藥效作用；有提高抗炎的免疫系統(tǒng)方面以及非特異性免疫功能的藥效作用。與此同時，蛇床子還具有抗菌、抗病毒、抗誘變、抗腫瘤等作用。蛇床子中含有的藥效成分主要以香豆素類為主，故本實驗中，蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制選擇蛇床子中含有的3種香豆素類成分。

蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素這3種香豆素類化合物的極性差比較大，故采用梯度洗脫方法。經(jīng)過對比實驗，并參考相關(guān)文獻，[2，4]最終確定乙腈-0.1%醋酸水溶液為流動相，檢測波長為322 nm。本研究以藥典方法為基準(zhǔn)，[1]建立了蛇床子配方顆粒中蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素3種香豆素類化合物HPLC定量分析方法，加強了蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制。本方法簡便、快捷、有效，3種化合物在HPLC圖譜中辨析度高，很好的體現(xiàn)了目前《中藥配方顆粒管理辦法(征求意見稿)》中對中藥配方顆粒質(zhì)量控制的新要求，從整體方面和多成份方面控制質(zhì)量，結(jié)果表明，本方法可對不同批次蛇床子配方顆粒的質(zhì)量差異進行全面評估，通過同時測定蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素這3種結(jié)構(gòu)相似的香豆素類成分的含量，能夠顯著提高蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制水平。

與此同時，研究人員還注意到蛇床子配方顆粒中的其他香豆素類成分在蛇床子配方顆粒HPLC圖譜中也有對應(yīng)的色譜峰，本次研究的結(jié)果，為將來更全面地進行蛇床子配方顆粒中藥效成分的定性鑒別和定量測定，奠定了基礎(chǔ)。

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(2017-03-16 收稿)

*河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目：No.ZD2015001；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目：No.2017017；河北中醫(yī)學(xué)院青年基金項目：No.700201601201420

牛麗穎，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

R284.2

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1007-5615(2017)03-0034-03