孫亞麗,史慶華,劉世琦,孫秀東,陳亞霏,錢勝艷,劉星辰

山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,作物生物學國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,山東 泰安 271018

基于SSR分子標記的大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

孫亞麗,史慶華,劉世琦*,孫秀東,陳亞霏,錢勝艷,劉星辰

山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,作物生物學國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,山東 泰安 271018

大蒜為無性繁殖作物，其生物學特征在經(jīng)歷氣候變遷、自然選擇和人工選擇后發(fā)生了多方面變異，從而形成了眾多地方品種。因此，研究大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性為大蒜的科學分類及品種鑒定、保存、遺傳改良提供科學依據(jù)。采用SSR（簡單重復序列，simple sequence repeats）分子標記技術對55份大蒜種質(zhì)的基因組DNA進行多態(tài)性擴增。用POPGENE version1.32軟件計算有效等位基因數(shù)Ne、Nei’s遺傳相似系數(shù)（GS）、遺傳距離（GD）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)等指標，并采用NTSYS pc 21-2軟件進行種質(zhì)間的UPGMA（非加權(quán)組平均法，un-weighted pair-group method）聚類分析和基于Nei’s遺傳距離的組群間聚類分析。結(jié)果表明，7對引物共擴增出75條帶，多態(tài)性條帶為73條（多態(tài)性比率為97.33%），每對引物平均擴增出10.71個位點和10.43個多態(tài)性位點，說明SSR分子標記揭示的多態(tài)性強。55份大蒜種質(zhì)的平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和平均Shannon信息指數(shù)分別為0.1335和0.2278。大蒜具有較高的遺傳多樣性，聚為一類的大蒜多來源于相同或相近區(qū)域。

大蒜;SSR;遺傳多樣性

大蒜（Allium sativum L.）為百合科蔥屬兩年生草本植物，原產(chǎn)于亞洲西部的高原地帶。我國大蒜種質(zhì)資源豐富，有世界上最大的栽培面積，約占全球大蒜種植面積的85%以上，總生產(chǎn)量以及出口量均居世界第一[1,2]。大蒜味道鮮美，營養(yǎng)豐富，據(jù)有特殊的香辛氣味，能促進消化，增進食欲，具有明顯的保健作用和藥用價值。

近年來，分子標記技術被廣泛應用于種質(zhì)鑒定與遺傳多樣性分析[3-6]廣泛應用在蔥屬類植物、大麥、花生、甘藍、西瓜、蘋果、大豆[7-15]等作物的連鎖圖構(gòu)建或親緣關系分析上。簡單序列重復(Simple sequence repeats,SSR)又稱微衛(wèi)星(Microsatellite)，是指以1～6個核苷酸為單位重復DNA序列。SSR標記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，且技術重復性好，易于操作，結(jié)果可靠[16]，使其成為遺傳多樣性分析中最常用的分子標記技術之一[17,18]。

大蒜雖為無性繁殖作物，但由于地理環(huán)境和氣候條件差異大，在不同的生態(tài)環(huán)境下，通過人為定向選擇培育和自然淘汰，使大蒜呈現(xiàn)多方面的變異。因此研究大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性，掌握其種源及分布規(guī)律，發(fā)掘優(yōu)良基因，合理利用現(xiàn)有的大蒜種質(zhì)資源培育新品種具有重要意義。本研究選用分布范圍較大的大蒜資源，采用SSR技術對其進行遺傳多樣性分析和親緣關系分析，旨在為大蒜種質(zhì)資源的收集、保護及利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2013～2014年山東農(nóng)業(yè)大學園藝作物生物學實驗室進行。供試的55份大蒜品種及來源見表1，收自國內(nèi)37份種質(zhì)材料，其中山東26份，河南3份，四川2份，新疆5份，臺灣1份，引進國外種質(zhì)材料18份，包括美國8份，日本2份，泰國2份，加拿大2份，烏克蘭2份，俄羅斯1份，歐洲1份。

表1 供試的55個大蒜品種及來源地Table 1 Names and sources of 55 garlic cultivars used in this study

1.2 基因組DNA提取

取植物新鮮組織100 mg或者干粉樣品30 mg，加入液氮充分研磨成粉末狀。樣品量不應超過100 mg（干粉樣品30 mg），過多的樣品使得裂解不充分，最終會導致基因組DNA提取量減少。實驗前在1.5 mL離心管中加入800 μL的Lysis Buffer，于65℃下預熱，然后加入β-巰基乙醇至終濃度為0.1%。將研磨好的粉末加到以上預備好的Lysis Buffer中，65℃水浴20～30 min，其間顛倒混勻樣品數(shù)次。加入500 μL氯仿，充分混勻，12000 rpm離心5 min。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700 μL Binding buffer，充分混勻。將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中（可分次轉(zhuǎn)入），12000 rpm離心1 min。加入700 μL Wash BufferA，12000 rpm離心1 min，棄廢液。加入700 μL Wash buffer B，12000 rpm離心1 min，棄廢液。加入500 μLl Wash buffer B，12000 rpm離心1 min，棄廢液。再次12000 rpm離心2 min，將離心柱置于新的離心管中，并打開離心柱蓋，于室溫或37℃放置5～10 min，至無明顯乙醇味。加入50～200 μL TE buffer(事先預熱55～65℃)，置于室溫2～5 min，12000 rpm離心2 min，離心管中即為所提取的基因組DNA溶液。

1.3 SSR-PCR擴增

1.3.1 SSR引物信息 本文采用Kyung-Ho[19]和Lee[20]開發(fā)的SSR引物，篩選出的7對引物（表2）。

表2 引物信息Table 2 Primer Information

1.3.2 反應體系 PCR反應設3次重復，體系為模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，Dntp 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dd H2O 18.5 μL，總體積25 μL。

1.3.3 反應條件 PCR擴增程序為94℃5 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒功率50 W電泳2.5 h，采用銀染色法顯色。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結(jié)果，凝膠相同遷移率位置上，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，構(gòu)成“0,1”矩陣。利用POPGENE version1.32軟件計算有效等位基因數(shù)Ne、Nei’s遺傳相似系數(shù)（GS）、遺傳距離（GD）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)等指標，并采用NTSYS pc 21-2軟件進行種質(zhì)間的UPGMA（非加權(quán)組平均法，unweighted pair-group method）聚類分析和基于Nei’s遺傳距離的組群間聚類分析。并利用NTSYS pc 21-2軟件進行種質(zhì)間的UPGMA（非加權(quán)組平均法）聚類分析和基于Nei’s遺傳距離的組群間的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物擴增的多態(tài)性

利用7對SSR引物對55份大蒜種質(zhì)材料進行擴增，共擴增出75條帶，其中73條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為97.33%，擴增多態(tài)性片段的長度在47～287 bp之間，每對引物的擴增效率存在一定的差異，平均每對引物擴增出10.71個位點和10.43個多態(tài)性位點，說明SSR分子標記揭示的多態(tài)性強且大蒜品種間的遺傳多樣性較為豐富。

2.2 大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性

利用POPGENE version1.32軟件對試驗數(shù)據(jù)進行各項參數(shù)的統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，樣品間的平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.1335，平均Shannon信息指數(shù)為0.2278，大蒜雖為無性繁殖植物，但具有一定的遺傳多樣性。

基于Nei’s相似性系數(shù)運用UPGMA法進行聚類分析（圖1），結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.773處，可將供試材料分為三類：i類分為30個品種，其中國內(nèi)品種25個，國外品種5個；ⅱ類分為24個品種，其中國內(nèi)品種11個，國外品種13個；ⅲ類僅新疆野蒜一個品種，與其他品種的相似系數(shù)為0.77。

在相似系數(shù)為0.861時，i類又可以分為4個亞類，A亞類23個品種來源廣泛，來自山東、四川、河南、臺灣以及日本；B亞類4個品種，均來自新疆；C亞類只有一個品種，為瑞士的歐洲小蒜；D亞類的2個品種均來自泰國。在相似系數(shù)為0.857處，ⅱ類又可以分為4個亞類，A亞類的13個品種分為來自山東、俄羅斯和美國；B亞類的4個品種來自加拿大和烏克蘭；C亞類的5個品種和D亞類的2個品種，均來自美國。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，除i-A和ⅱ-A外，每一類的大蒜多來源于相同或相近區(qū)域，表明大蒜遺傳多樣性受地域來源影響較大。

圖1 55份大蒜種質(zhì)基于7對引物的SSR分析和UPGMA聚類結(jié)果Fig.1 Dendrogram of 55 garlic accessions based on SSR analysis with 7 pair primers combination

2.3 不同地域來源大蒜種質(zhì)資源的遺傳一致度和聚類結(jié)果

利用POPGENE version1.32軟件計算不同地域來源大蒜種質(zhì)資源群體間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)（Nei's，1978），從表3中可以看出，8個資源群的遺傳相似系數(shù)分布為0.8546～0.9980，其中中南群體和西南群體的遺傳相似系數(shù)最高，為0.9980，遺傳距離最近；而西北群體和北美群體的遺傳相似系數(shù)最低，為0.8546，遺傳距離最遠。

表3 10個大蒜種質(zhì)資源群間的Nei's遺傳相似系數(shù)（對角線上方）、遺傳距離（對角線下方）Table 3 Nei’s genetic identity(above diagonal)and genetic distance(below diagonal)among the ten groups of garlic populations separated by geographical distributions

2.4 不同地域來源大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性

為進一步分析大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性與其地域來源的關系以及不同區(qū)域大蒜種質(zhì)資源的親緣關系，將55份材料按照地理區(qū)域劃分為8個（來自臺灣的只有一個品種，除外）群體。經(jīng)POPGENE version1.32軟件計算Shannon信息指數(shù)（表4）。8個群體總體Shannon信息指數(shù)變化范圍是0.0242-0.1792，各群體多樣性指數(shù)由高到低依次為華東群體、歐洲群體、北美群體、西北群體、中南群體、西南群體、日本群體、泰國群體，總體來看，國內(nèi)群體的Shannon信息指數(shù)略大于國外群體，其中，華東群體Shannon信息指數(shù)最高，遺傳多樣性最為豐富。

表4 10個大蒜種質(zhì)資源群間的SSR分析Table 4 Ten groups of garlic populations separated by SSR analysis

根據(jù)群體間遺傳相似系數(shù)，運用NTSYS軟件進行聚類（圖2），可以看出，8個種質(zhì)資源群體在遺傳相似系數(shù)0.91處聚成3類，其中第一類包括華東群體、中南群體、西南群體和日本群體；第二類包括西北群體、北美群體和歐洲群體；第三類是泰國群體。

圖2 基于Nei’s遺傳相似系數(shù)對8個大蒜群體的UPGMA聚類結(jié)果Fig.2 Dendrogram of 8 garlic populations based on Nei’s genetic identity

3 討論

試驗采用的7對SSR引物共擴增出73條多態(tài)性條帶，平均每對引物10.43條，揭示的多態(tài)性強。

采用NTSYS pc 21-2軟件對55份大蒜種質(zhì)資源進行種質(zhì)間的UPGMA聚類分析，通過對聚類圖的分析發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)的某些大蒜種質(zhì)之間的親緣關系與其地域分布有一定的關系，但不存在必然聯(lián)系。聚類圖中的第一大類中，除歐洲小蒜外，第一大類中的所有品種均來自亞洲；第二大類中除山東金鄉(xiāng)系列大蒜外，其他種質(zhì)材料均屬于國外品種。

對55份大蒜種質(zhì)聚類圖分析發(fā)現(xiàn)，同一地域來源的種質(zhì)大都被聚在一起，如新疆區(qū)域的四份種質(zhì)材料，與王海平等[21]和陳書霞[16]試驗結(jié)果相同；不同地域來源的種質(zhì)也有可能被聚在一類，如加拿大的2份種質(zhì)材料和烏克蘭的2份種質(zhì)材料，加拿大和烏克蘭雖然不在同一區(qū)域，但是緯度相近，溫度和光照等環(huán)境條件相似，說明相似的地理環(huán)境對大蒜遺傳多樣性的影響相同；同一地域來源的種質(zhì)也可能不被聚到一類，如山東的蒼山系列大蒜和金鄉(xiāng)系列大蒜，雖然同屬于山東區(qū)域且兩地地理位置較近，但是在相似系數(shù)0.811處，分別聚類到兩個不同的大類中，說明大蒜種質(zhì)材料本身具有復雜的遺傳多樣性，金鄉(xiāng)系列大蒜和美國大蒜、加拿大大蒜、烏克蘭大蒜、俄羅斯大蒜被聚到第二大類中，說明金鄉(xiāng)系列大蒜可能是大蒜區(qū)域相互引種交流的結(jié)果，1991年之前李文家從蘇聯(lián)引進蘇聯(lián)大蒜，而金鄉(xiāng)系列大蒜與俄羅斯大蒜又被聚到同一亞類中，說明金鄉(xiāng)系列大蒜和俄羅斯大蒜有一定的親緣關系，金鄉(xiāng)系列大蒜應該是蘇聯(lián)大蒜引進的選育品種。大蒜區(qū)域間的品種交流使得大蒜種質(zhì)來源復雜。

本研究利用SSR分子標記分析大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，從大蒜本身遺傳信息分析了其親緣關系，為大蒜種質(zhì)的收集、保護和新品種選育提供理論依據(jù)和技術支持。

4 結(jié)論

大蒜品種間的遺傳多樣性受地域影響較大，大蒜區(qū)域間的品種交流頻繁使種質(zhì)來源復雜，SSR分子標記技術對大蒜基因組檢測多態(tài)性水平高，可有效揭示其遺傳多樣性。

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The Study on the Genetic Diversity of Garlic Germplasm Based on SSR Molecular Marker

SUN Ya-li,SHI Qing-hua,LIU Shi-qi*,SUN Xiu-dong,CHEN Ya-fei,QIAN Sheng-yan,LIU Xing-chen
College of Horticulture Science and Engineering,State Key Laboratory of Crop Biology,Agriculture Ministry Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(Huanghuai Region)/Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China

Garlic is an asexual reproductive crop,a lot of local varieties were formed due to the mutation induced by climate change,natural selection and artificial selection.The research on genetic diversity of Garlic Germplasm Resources provided scientific basis for garlic scientific classification,identification,preservation and genetic improvement.Simple sequence repeats(SSR)molecular marker technique was used for polymorphic amplification for genomic DNA of 55 garlic germplasm. POPGENE version1.32 software calculated the effective bit gene number,Nei’s genetic similar coefficient,genetic distance, Nei’s genetic diversity index and Shannon's information index and other indicators.NTSYS PC software was used for UPGMA(non weighted average method)cluster analysis and inter cluster analysis of genetic distance based on Nei's.The results show that 75 bands were obtained from 7 pairs of primers,among which 73 bands showed polymorphic bands (97.33%).Each pair of primers amplified 10.71 loci and 10.43 polymorphic loci,SSR molecular markers have strong polymorphism.The genetic diversity index and the average information index of 55 garlic accessions were 0.1335 and 0.2278. Garlic has a high genetic diversity,the most of garlic known as one category was from the same or similar area.

Garlic;SSR;genetic diversity

S633.4

:A

:1000-2324(2017)03-0384-06

2015-10-22

:2015-11-20

國家自然科學基金(31372084);國家公益性行業(yè)科研專項(200903018);“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃(2013BAD01B04)

孫亞麗(1991-),女,碩士研究生.研究方向為蔬菜學.E-mail:yalisun2013@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:liusq99@sdau.edu.cn