盧艷娟 王小芳 曾 潔 陳玉林 張恩平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌712100)

飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)量的影響

盧艷娟 王小芳 曾 潔 陳玉林 張恩平*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌712100)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)量的影響。選取112只健康、體重相近的灘羊，隨機(jī)分成4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)7只羊。標(biāo)準(zhǔn)水平的飼糧能量和蛋白質(zhì)水平參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)，各組試驗(yàn)灘羊分別飼喂不同能量和蛋白質(zhì)水平飼糧：0.84×標(biāo)準(zhǔn)水平(Ⅰ組)、0.96×標(biāo)準(zhǔn)水平(Ⅱ組)、1.08×標(biāo)準(zhǔn)水平(Ⅲ組)和1.20×標(biāo)準(zhǔn)水平(Ⅳ組)。試驗(yàn)根據(jù)羊體重分2個(gè)階段：29～35 kg和36～40 kg。于每個(gè)階段末，每個(gè)重復(fù)屠宰1只試驗(yàn)羊，取其小腸組織樣，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(PepT1)、y+型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(CAT1)、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體3(EAAT3)mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：1)在29～35 kg階段末，小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的提高呈先下降再上升的趨勢，Ⅱ組顯著低于其他3組(P<0.05)；Ⅳ組小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量顯著高于其他3組(P<0.05)；Ⅲ組小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量顯著高于其他3組(P<0.05)。2)在36～40 kg階段末，Ⅱ組小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量顯著高于其他3組(P<0.05)；Ⅱ組小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量顯著高于Ⅲ組(P<0.05)；小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的提高呈上升趨勢，Ⅲ組和Ⅳ組小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)。由此可見，飼糧能量和蛋白質(zhì)水平會影響灘羊小腸中PepT1、CAT1、EAAT3 mRNA的表達(dá)量，使機(jī)體對小肽和氨基酸的吸收利用率隨之改變，以適應(yīng)灘羊的生長發(fā)育。

灘羊；能量和蛋白質(zhì)水平；小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體；mRNA表達(dá)量

動物從飼糧中攝入的營養(yǎng)物質(zhì)需要經(jīng)過胃腸道的一系列消化過程分解為小分子物質(zhì)才能被機(jī)體吸收利用。蛋白質(zhì)在消化酶的作用下分解為小肽和游離的氨基酸[1]，二者均為極性小分子物質(zhì)，不能通過細(xì)胞膜的疏水區(qū)，需要在相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體的協(xié)助下通過胃腸道黏膜進(jìn)入體循環(huán)，供機(jī)體不同組織利用[2]。目前，已知的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT)有5種[3]，其中，PepT1是一種腸道肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，具有低親和力、高容量[4]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的發(fā)展較為完善，根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物特異性可以分為3類：堿性、中性和酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包括B0,+、b0,+、y+、y+L堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。其中，B0,+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是鈉離子(Na+)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，非Na+依賴的y+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是典型的單向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，主要分布在上皮細(xì)胞的基底部位，順著膜兩側(cè)的電勢梯度轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸[5]。y+型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(CAT)共有4個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CAT1～4)，其中CAT1是最主要且研究最多的，它分布廣泛，除了肝臟幾乎所有組織中都有，對L型精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸等堿性氨基酸具有高親和力[6]。b0,+堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是一種異二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，它可以轉(zhuǎn)運(yùn)堿性氨基酸和部分中性氨基酸，但是轉(zhuǎn)運(yùn)中性氨基酸的能力較堿性氨基酸弱，尤其對精氨酸有很高的親和力[7]。中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)最龐大，包括A、ASC、N和L轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，它們幾乎存在于所有類型的細(xì)胞[6]，且大多數(shù)酸性氨基酸載體具有親和力和專一性。酸性氨基酸在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過高親和力的鈉鉀依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)完成的，該系統(tǒng)的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(EAAT)主要有EAAT1～5[8-9]，其中EAAT3幾乎在所有的組織中均有表達(dá)，并在小腸分布最多[10]，主要轉(zhuǎn)運(yùn)L-谷氨酸和天冬氨酸[11]。大量研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性和數(shù)量受多種因素的影響，但飼糧能量和蛋白質(zhì)水平及動物的發(fā)育階段是影響小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的重要因素。因此，本試驗(yàn)通過飼喂灘羊不同能量和蛋白質(zhì)水平的飼糧，對其腸道PepT1、CAT1、EAAT3 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行研究，從而為合理配制階段性灘羊飼糧提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)所用動物為寧夏灘羊，飼養(yǎng)于寧夏回族自治區(qū)吳忠市紅寺堡天源良種繁育有限公司。選取體重相近的5月齡左右健康灘羊112只，公母各占1/2。將112只試驗(yàn)灘羊隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)7只羊，且每個(gè)重復(fù)7只羊?yàn)?組進(jìn)行飼喂。所有試驗(yàn)灘羊自由采食和飲水，每天飼喂3次。

1.2 試驗(yàn)飼糧與試驗(yàn)處理

標(biāo)準(zhǔn)水平的飼糧能量和蛋白質(zhì)水平參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)，根據(jù)灘羊生長發(fā)育規(guī)律分為29～35 kg和36～40 kg 2個(gè)生長階段，按日增重200 g設(shè)計(jì)各生長階段標(biāo)準(zhǔn)飼糧，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅳ組飼喂能量和蛋白質(zhì)水平分別為0.84×標(biāo)準(zhǔn)水平、0.96×標(biāo)準(zhǔn)水平、1.08×標(biāo)準(zhǔn)水平、1.20×標(biāo)準(zhǔn)水平的4種飼糧，其他營養(yǎng)水平基本一致。飼糧用全價(jià)顆粒料，各階段飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 各階段飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets at different stages (DM basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items第1階段(29～35kg)Thefirststage(29～35kg)組別GroupsⅠ(84%)Ⅱ(96%)Ⅲ(108%)Ⅳ(120%)第2階段(36～40kg)Thesecondstage(36～40kg)組別GroupsⅠ(84%)Ⅱ(96%)Ⅲ(108%)Ⅳ(120%)粗脂肪EE2.261.971.974.862.132.041.912.52粗纖維CF17.0520.9821.9723.9618.6520.8118.5224.11粗灰分Ash7.875.615.244.918.176.095.924.89鈣Ca0.930.891.241.540.930.900.901.54磷P0.390.340.400.490.370.370.310.49

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provides the following per kg of diet：VA 7 500 IU,VD 1 050 IU,VE 10 IU,Fe 5 500 mg，Mn 5 000 mg，Zn 4 000 mg，Se 32.5 mg，Co 32.5 mg。

2)營養(yǎng)水平中消化能及干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量按常規(guī)方法測定[12]，粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣和磷含量是根據(jù)原料組成計(jì)算所得(干物質(zhì)基礎(chǔ))，方法參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價(jià)值表》(2015年第26版)制訂說明[13]。The DE and DM and CP contents in the nutrient levels are measured by conventional methods[12], EE, CF, Ash, Ca and P contents are calculated based on the obtained raw material composition (dry matter basis), and referencedFeedingStandardofSheep(NY/T 816—2004) andTablesofFeedCompositionandNutritiveValuesinChina(2015 twenty-sixty edition)[13].

1.3 樣品采集

于每階段末每個(gè)重復(fù)選取1只試驗(yàn)羊(最接近組內(nèi)平均體重)，頸動脈放血至死(屠宰前不禁食)，采集小腸組織樣品2 cm2，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水沖洗干凈，濾紙吸干，迅速包裹于錫箔紙里，置液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取

采用康為世紀(jì)超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)，按照操作手冊提取小腸和肌肉組織總RNA。用核酸定量儀測定RNA濃度和純度，吸光度(OD)260 nm/OD280 nm=1.8～2.0，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，評定RNA質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 cDNA第1條鏈的合成

按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)操作說明合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank公布的綿羊β-肌動蛋白(β-actin)、PepT1、CAT1、EAAT3的mRNA序列，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并用Primer-BLAST軟件進(jìn)行引物特異性鑒定，然后送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其中綿羊β-actin為內(nèi)參基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表2。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按上述步驟將試劑和樣品混勻后，采用三步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃先預(yù)變性1 min，之后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度為55～95 ℃。根據(jù)熔解曲線是否單一峰判斷反應(yīng)的特異性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有樣品以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正處理，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的表達(dá)量(n=4)，先用Excel 2007整理原始數(shù)據(jù)，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示，P<0.05表示為差異顯著。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequence for real-time quantitative PCR

F：上游引物 forward primer；R：下游引物 reverse primer。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1 mRNA表達(dá)量的影響

由圖1可知，在29～35 kg階段末，Ⅱ組小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量最低，顯著低于其他3組(P<0.05)，這可能跟物種和試驗(yàn)動物的生長階段有關(guān)。在36～40 kg階段末，Ⅱ組小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量顯著高于其他3組(P<0.05)，且其他3組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中CAT1 mRNA表達(dá)量的影響

由圖2可知，在29～35 kg階段末，隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的增加，Ⅳ組小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量最高，顯著高于其他3組(P<0.05)，且其他3組間無顯著差異(P>0.05)。在36～40 kg階段末，Ⅱ組小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量顯著高于Ⅲ組(P<0.05)，與Ⅰ組、Ⅳ組間差異不顯著(P>0.05)，且Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間差異也不顯著(P>0.05)，但是Ⅲ組最低。

2.3 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中EAAT3 mRNA表達(dá)的影響

由圖3可知，在29～35 kg階段末，Ⅲ組小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量最高，顯著高于其他3組(P<0.05)，但其他3組間無顯著差異(P>0.05)。在36～40 kg階段末，Ⅲ組和Ⅳ組小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組(P<

0.05)，且隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的增加，小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量呈逐漸上升趨勢。

同一階段，數(shù)據(jù)柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖中的具體數(shù)據(jù)見表3，每個(gè)數(shù)據(jù)的重復(fù)數(shù)(n)為4。下圖同。

At the same stage, value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The specific data in the figure are shown in Table 3, the number of repetitions of each data (n) is 4. The same as below.

圖1 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1 mRNA表達(dá)量的影響

Fig.1 Effects of dietary energy and protein levels onPepT1 mRNA expression in the small intestine ofTansheep

圖2 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊 小腸中CAT1 mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of dietary energy and protein levels on CAT1 mRNA expression in the small intestine of Tan sheep

圖3 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊 小腸中EAAT3 mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of dietary energy and protein levels on EAAT3 mRNA expression in the small intestine of Tan sheep

2.4 階段與飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1、CAT1和EAAT3 mRNA表達(dá)量的影響

由表3可知，在29～35 kg階段末，Ⅱ組小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量最低，顯著低于其他3組(P<0.05)；但在36～40 kg階段末，Ⅱ組最高，顯著高于其他3組(P<0.05)，其他3組間差異均不顯著(P>0.05)。在29～35 kg階段末，Ⅳ組小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量最高，顯著高于其他3組(P<0.05)；在36～40 kg階段末，Ⅲ組最低，顯著低于Ⅱ組(P<0.05)，其他各組間差異不顯著(P>0.05)。在29～35 kg階段末，Ⅲ組小腸中EAAT3 mRNA表達(dá)量顯著高于其他3組(P<0.05)；在36～40 kg階段末，Ⅲ組、Ⅳ組顯著高于Ⅰ組、Ⅱ組(P<0.05)。小腸中PepT1、CAT1 mRNA的表達(dá)量均存在階段與能量和蛋白質(zhì)水平的互作效應(yīng)(P<0.001、P=0.005)，小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量不存在階段與能量和蛋白質(zhì)水平的互作效應(yīng)(P=0.118)。

3 討 論

3.1 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1 mRNA表達(dá)量的影響

PepT1 mRNA的表達(dá)調(diào)控可能有2個(gè)途徑：一是增加PepT1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；二是增加mRNA編碼基因的穩(wěn)定性，即翻譯水平[14]。朱宇旌等[15]認(rèn)為，PepT1的活性調(diào)控具有可塑性，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，PepT1能夠快速適應(yīng)其變化。然而，飼糧和腸腔內(nèi)底物的濃度會影響小腸營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)活性，從而影響腸道營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)有大量試驗(yàn)表明飼糧蛋白質(zhì)水平可能上調(diào)PepT1基因的活性。Ostaszewska等[16]研究表明，分別用不同的蛋白質(zhì)源(游離氨基酸、二肽和完整蛋白質(zhì))飼喂鱈魚，飼喂游離氨基酸和二肽的鱈魚不僅體內(nèi)PepT1 mRNA的表達(dá)量顯著增加，且平均體重比飼喂完整蛋白質(zhì)的鱈魚顯著增加(大約8倍)。Ferraris等[17]研究發(fā)現(xiàn)：相比低蛋白質(zhì)飼糧(18%)，高蛋白質(zhì)飼糧(72%)會使小鼠空腸對二肽的吸收量提高30%～70%。另有研究表明，限飼、禁食或營養(yǎng)不良會導(dǎo)致小腸吸收面積減少，所以隨著日齡增加，限飼會使?fàn)I養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)增加[18]。Bucking等[19]通過短期禁食，發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)PepT1 mRNA的表達(dá)量上調(diào)，但長期禁食反而使其下降。Chen等[20]比較了飼糧蛋白質(zhì)水平為12%、18%、24%與飼糧蛋白質(zhì)水平為18%和24%時(shí)限制飼喂對雞小腸PepT1 mRNA的表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示飼糧蛋白質(zhì)水平為12%時(shí)隨日齡雞小腸PepT1 mRNA的表達(dá)量呈下降趨勢，飼糧蛋白質(zhì)水平為18%和24%時(shí)限制飼喂其表達(dá)量呈上升趨勢，但進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼糧蛋白質(zhì)水平為24%自由采食時(shí)，PepT1 mRNA的表達(dá)量反而下降。

表3 階段與飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1、CAT1和EAAT3 mRNA表達(dá)量的影響Table 3 Effects of stage and dietary energy and protein levels on PepT1, CAT1 and EAAT3 mRNA expressions in the small intestine of Tan sheep (n=4)

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05), while with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

試驗(yàn)證明，PepT1的表達(dá)受蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的影響，底物含量過多或過少都會增加PepT1的表達(dá)。當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)會增加轉(zhuǎn)運(yùn)載體的數(shù)量和活性來增加對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，充分吸收利用底物，而低濃度時(shí)，機(jī)體又有一種補(bǔ)償機(jī)制來增加載體的表達(dá)，供機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，保證正常生命活動的需要[9]。氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)受多種途徑的共同調(diào)節(jié)，其表達(dá)量可能受試驗(yàn)物種、飼糧、生長階段、激素等的影響[6]。由本實(shí)驗(yàn)室田春麗[21]的研究可知，飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對PepT1 mRNA的表達(dá)量的影響與采食量無關(guān)，可能與小肽的攝入量有關(guān)。本試驗(yàn)中，在29～35 kg階段末，Ⅱ組小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量最低，其他3組都顯著高于Ⅱ組，且這3組之間無顯著差異。此階段小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量變化與前人的結(jié)果[21]有一些差異，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在36～40 kg階段末，Ⅱ組小腸中PepT1 mRNA的表達(dá)量最高，其他3組之間無顯著差異，這與前人的結(jié)果[21]一致。

3.2 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中CAT1 mRNA表達(dá)量的影響

CAT1是一種非鈉離子依賴性的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，具有高親和力，已經(jīng)被證明在胃腸道上皮細(xì)胞的頂膜與底膜中都發(fā)生表達(dá)。它主要轉(zhuǎn)運(yùn)賴氨酸與精氨酸，而這2種陽離子氨基酸都是羊的限制性氨基酸。CAT1屬于y+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，通過膜兩側(cè)的電勢梯度單向轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸[22]。飼糧對氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的影響，主要是飼糧的蛋白質(zhì)含量和組成可以改變胃腸道中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的底物濃度，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。當(dāng)氨基酸含量充足時(shí)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性低(適應(yīng)性抑制)；當(dāng)氨基酸含量較低時(shí)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性高(適應(yīng)性阻遏)。生理學(xué)上，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)可以作為細(xì)胞的有限氨基酸供應(yīng)的防御機(jī)制的一部分，在去阻遏期間，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)可以為細(xì)胞提供蛋白質(zhì)，使氨基酸快速流入細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)正常生長[23]。石常友等[24]試驗(yàn)用不同蛋白質(zhì)水平飼糧喂育肥豬，結(jié)果高蛋白質(zhì)水平(19%)飼糧與低蛋白質(zhì)水平(13%)飼糧均可顯著提高肥育豬十二指腸和空腸CAT1 mRNA的表達(dá)量。而柏明娜[25]對愛拔益加(AA)肉雞進(jìn)行CAT1 mRNA表達(dá)量分析，結(jié)果表明隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的提高，表達(dá)量有下降的趨勢，但是差異不顯著。寧良川[26]用不同蛋白質(zhì)水平的飼糧飼喂家兔，結(jié)果顯示空腸和回腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量隨著蛋白質(zhì)水平的升高顯著上調(diào)。石常友等[24]的研究表明，不同飼糧蛋白質(zhì)水平對CAT1 mRNA的表達(dá)量的影響可能與蛋白質(zhì)和堿性氨基酸的攝入量有關(guān)，與采食量無關(guān)。根據(jù)田春麗[21]的研究結(jié)果，飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊的平均日采食量沒有顯著影響，所以本試驗(yàn)飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對小腸中CAT1 mRNA表達(dá)量的影響與灘羊的平均日采食量無關(guān)，本試驗(yàn)在29～35 kg階段末，隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的提高，Ⅳ組小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量最高，這與上述的研究結(jié)果基本一致。而前3組隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的提高，小腸中CAT1 mRNA的表達(dá)量呈下降趨勢，這與石常友等[24]的研究結(jié)果一致。

3.3 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中EAAT3 mRNA表達(dá)量的影響

EAAT是Na+依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)載體，對酸性氨基酸(主要是谷氨酸和天冬氨酸)有高親和力，EAAT3是其中研究最為廣泛的一種，幾乎在所有組織都有分布，對酸性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)有重要的意義[27]。飼糧的營養(yǎng)水平會影響EAAT3基因的表達(dá)。Howell等[28]試驗(yàn)表明，在保證羔羊攝入相同量的飼糧蛋白質(zhì)條件下，供給羔羊不同能量的飼糧，結(jié)果顯示高能量飼糧組的EAAT3的蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著升高。寧良川[26]對家兔的研究表明，隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的升高，腸道內(nèi)環(huán)境中的可消化蛋白質(zhì)水平升高，底物增加使得十二指腸和空腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量也增加。另外，Howell等[28]研究表明，通過增加谷氨酸底物濃度可以增加EAAT3 mRNA的表達(dá)量，從而促進(jìn)育肥羊生長和組織代謝。本試驗(yàn)在29～35 kg階段，羔羊正處于快速生長階段，隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的增加，Ⅲ組小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量最大，Ⅳ組表達(dá)量和Ⅰ組和Ⅱ組無顯著差異。本試驗(yàn)飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量的影響與采食量無關(guān)，可能是隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的提高，腸道中可消化蛋白質(zhì)含量增加，氨基酸底物濃度也隨之升高，在一定范圍內(nèi)，小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量隨著底物濃度的升高而增加，當(dāng)飼糧蛋白質(zhì)水平過高時(shí)，腸道內(nèi)氨基酸底物濃度達(dá)到飽和，就會出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量隨之降低，但和前2組沒有顯著差異。在36～40 kg階段，生長發(fā)育開始變慢，脂肪開始大量沉積，隨著飼糧能量和蛋白質(zhì)水平的升高，小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量逐漸增加，這可能是大量沉積脂肪的需要。

3.4 階段與飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1、CAT1和EAAT3 mRNA表達(dá)量的影響

張愛華等[29]的研究表明，AA肉仔雞PepT1 mRNA的表達(dá)量存在腸段與日齡的互作效應(yīng)，而EAAT3 mRNA的表達(dá)量不存在腸段與日齡的互作效應(yīng)。本研究表明，小腸中PepT1、CAT1 mRNA的表達(dá)量均存在階段與能量和蛋白質(zhì)水平的互作效應(yīng)，不同階段隨著能量和蛋白質(zhì)水平的提高，基因的表達(dá)量不同。小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量不存在階段與能量和蛋白質(zhì)水平的互作效應(yīng)。這說明小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量分別受階段及能量和蛋白質(zhì)水平的影響，但二者之間無互作效應(yīng)，這可能跟飼糧組成和灘羊生長發(fā)育階段的特點(diǎn)有關(guān)。

4 結(jié) 論

① 飼糧能量和蛋白質(zhì)水平對灘羊小腸中PepT1、CAT1和EAAT3的表達(dá)量在29～35 kg和36～40 kg階段都有顯著影響。

②灘羊小腸中PepT1、CAT1 mRNA的表達(dá)量均存在階段×能量和蛋白質(zhì)水平的互作效應(yīng)，小腸中EAAT3 mRNA的表達(dá)量不存在階段與能量和蛋白質(zhì)水平的互作效應(yīng)。

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*Corresponding author, professor, E-mail： zhangenping@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Dietary Energy and Protein Levels on mRNA Expression of Small Peptide and Amino Acid Transporters in Small Intestine ofTanSheep

LU Yanjuan WANG Xiaofang ZENG Jie CHEN Yulin ZHANG Enping*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China)

This experiment was conducted to study the effects of dietary energy and protein levels on mRNA expression of small peptide and amino acid transporters in small intestine ofTansheep. A total of 112 healthyTansheep with similarly body weight were randomly divided into 4 groups with 4 replicates per group and 7 sheep per replicate. The standard level diet referencedFeedingStandardofSheep(NY/T 816—2004), sheep in the 4 groups were fed diet with different energy and protein levels diets: 0.84×standard level (group Ⅰ), 0.96×standard level (group Ⅱ), 1.08×standard level (group Ⅲ) and 1.20×standard level (group Ⅳ), respectively. The test period were divided into two stages by body weight of sheep： 29 to 35 kg and 36 to 40 kg. At the end of each stage, one sheep was slaughtered at each replicate, and small intestinal samples were collected to study the expression of peptide transporter 1 (PepT1), y+cationic amino acid transporter 1 (CAT1)and excitatory amino-acid transporter 3 (EAAT3) mRNA by real-time PCR. The results showed as follows: 1) at the end of 29 to 35 kg stage, the small intestinePepT1 mRNA expression firstly decreased and then increased with diet energy and protein levels increased, and the small intestinePepT1 mRNA expression in group Ⅱ was significantly higher than that in other three groups (P<0.05); the small intestineCAT1 mRNA expression in group Ⅳ was significantly higher than that in other three groups (P<0.05); the small intestineEAAT3 mRNA expression in group Ⅲ was significantly higher than that in other three groups (P<0.05). 2) At the end of 36 to 40 kg stage, the small intestinePepT1 mRNA expression in group Ⅱ was significantly higher than that in other three groups (P<0.05); the small intestineCAT1 mRNA expression in group Ⅱ was significantly higher than that in group Ⅲ (P<0.05); the small intestineEAAT3 mRNA expression had a significantly rise trend with diet energy and protein levels increased, and the small intestineEAAT3 mRNA expression in group Ⅲ and group Ⅳ was significantly higher than that in group Ⅰ and group Ⅱ (P<0.05). In conclusion, dietary energy and protein levels can significantly affect the mRNA expression ofPepT1,CAT1 andEAAT3 in small intestine ofTansheep, which can change the absorption and utilization of the small peptides and amino acids to adapt toTansheep’s growth and development.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(6)：2170-2178]

Tansheep; energy and protein levels; small peptide and amino acid transporters; mRNA expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.06.040

2016-12-07

國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-40-13)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303059)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K01-17-03)；陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014K01-17-04)

盧艷娟(1992—)，女，山西陽城人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: 1249359361@qq.com

*通信作者:張恩平，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： zhangenping@nwsuaf.edu.cn

S826

A

1006-267X(2017)06-2170-09