楊樂(lè)柳柯楊仕明龔平桂劉昀逸張軍軍汪雪梅彭宏

1南方醫(yī)科大學(xué)（廣州510515）

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）

3中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100039）

4廣東省第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510310）

C57小鼠毛細(xì)胞突觸帶的發(fā)育觀察

楊樂(lè)1,4柳柯2楊仕明3龔平桂4劉昀逸1張軍軍1汪雪梅4彭宏4

1南方醫(yī)科大學(xué)（廣州510515）

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）

3中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100039）

4廣東省第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510310）

目的了解C57小鼠耳蝸毛細(xì)胞突觸帶發(fā)育的時(shí)間特點(diǎn)。方法全耳蝸基底膜鋪片后免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察和記錄不同發(fā)育階段C57小鼠聽(tīng)覺(jué)突觸前膜突觸帶的數(shù)目與分布。運(yùn)用ABR檢測(cè)聽(tīng)力發(fā)生的時(shí)間。結(jié)果C57小鼠出生后0d，在內(nèi)外毛細(xì)胞胞質(zhì)即可觀察到Ctbp2信號(hào)；出生后第3天，Ctbp2信號(hào)在毛細(xì)胞上逐漸增多；出生后第6天，Ctbp2信號(hào)在毛細(xì)胞的胞質(zhì)和基底側(cè)膜上的表達(dá)達(dá)高峰，內(nèi)毛細(xì)胞（35.1±3.4）個(gè)/細(xì)胞，而外毛細(xì)胞上的增加更為顯著，達(dá)（21.0±3.2）個(gè)/細(xì)胞；出生后第12、30和60天，Ctbp2信號(hào)數(shù)目趨于穩(wěn)定，在內(nèi)毛細(xì)胞16-20個(gè)/細(xì)胞，外毛細(xì)胞1-3個(gè)/細(xì)胞，信號(hào)的分布也逐漸聚集在毛細(xì)胞的基底側(cè)膜上。ABR檢測(cè)提示C57小鼠聽(tīng)覺(jué)發(fā)生的平均時(shí)間為13.2天。結(jié)論毛細(xì)胞突觸帶出生時(shí)即已存在，出生后逐漸發(fā)育和完善。聽(tīng)覺(jué)發(fā)生與突觸帶成熟時(shí)間上的高度吻合，表明成熟突觸帶的形成可能是聽(tīng)覺(jué)發(fā)生的前提條件之一。

毛細(xì)胞；突觸帶；發(fā)育；聽(tīng)覺(jué)發(fā)生

Projectsupported by the NationalNature Science Foundation of China(GrantNo.81572666).

Declaration of interest:Theauthors reportno conflictsof interest.

毛細(xì)胞與聽(tīng)覺(jué)傳入神經(jīng)間的信號(hào)傳遞依賴于毛細(xì)胞基底側(cè)膜上特化的帶狀突觸（Ribbon Syn?apse，RS）[1]。在每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞（Inner Hair Cell，IHC）上有20-30根I型螺旋神經(jīng)元的軸突與之形成連接，而每個(gè)外毛細(xì)胞（Outer Hair Cell，OHC）則僅與1-3根II型螺旋神經(jīng)元的軸突相連[2-4]。經(jīng)典的毛細(xì)胞/傳入神經(jīng)連接的復(fù)合單位包括一個(gè)突觸帶（Synaptic Ribbon）結(jié)構(gòu)圍繞以致密神經(jīng)遞質(zhì)囊泡形成的可快速釋放池以及與之間隔的突觸后神經(jīng)末梢膜遞質(zhì)受體斑[5]。突觸帶的存在使得聽(tīng)覺(jué)信息可瞬時(shí)、持續(xù)及高保真地由內(nèi)毛細(xì)胞傳入相連的聽(tīng)覺(jué)纖維[6]。然而，突觸帶結(jié)構(gòu)又易受外界因素影響，如衰老[7]、噪聲暴露[8]、基因突變[9]、耳毒性藥物[10]等都會(huì)損害突觸帶的形態(tài)和數(shù)目，引起不同程度和性質(zhì)的聽(tīng)覺(jué)損傷，表明突觸帶對(duì)正常聽(tīng)功能的維持具有重要的意義。因此，認(rèn)識(shí)毛細(xì)胞突觸帶的發(fā)育特性對(duì)進(jìn)一步理解與闡釋聽(tīng)覺(jué)生理具有重要意義。

本研究中，我們選取0d、3d、6d、12d、30d和60d C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)免疫熒光單標(biāo)突觸帶的特異結(jié)構(gòu)蛋白（C-terminalbind protein，Ctbp2）實(shí)現(xiàn)對(duì)耳蝸基底膜上的突觸帶的標(biāo)記，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡對(duì)耳蝸不同區(qū)域每一層面的突觸帶進(jìn)行單通道掃描后行最大灰度疊加，觀察和分析毛細(xì)胞突觸帶在聽(tīng)覺(jué)發(fā)生前后數(shù)量和分布上的時(shí)域變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

0、3、6、12、30和60日齡SPF級(jí)C57小鼠（軍科動(dòng)物中心）各5只，雄雌不限。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

鼠源性Ctbp2抗體（1:100,美國(guó)BD公司）；Al?exa Fluorence標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1:400,美國(guó)LIFE公司）；免洗DAPI液（4',6-Diamidino-2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚；中杉金橋）。

1.2方法

1.2.1耳蝸基底膜制備

剪刀斷頭乳鼠后取出顳骨，解剖顯微鏡下迅速分離耳蝸，開(kāi)放圓窗和卵圓窗，用細(xì)鑷在蝸尖鉆孔，4%多聚甲醛緩沖液經(jīng)圓窗、卵圓窗灌流，并4℃固定過(guò)夜8-12h后，放入10%EDTA溶液中脫鈣6-12h (6d后小鼠需脫鈣)。解剖顯微鏡下于0.1mmol/L PBS中從頂回向底回剝除蝸殼，切除螺旋韌帶，清除前庭膜及蓋膜。

1.2.2免疫熒光染色

Ctbp2和DAPI標(biāo)記：將分離好的基底膜置于1%Triton X-100中30 min后，PBS沖洗3次，10-15min/次；5%山羊血清封閉1h；加一抗，鼠源性Ctbp2抗體（1:100）4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，15-20min/次；加二抗，37℃孵育1h，PBS沖洗3次，15-20min/次。DAPI染色：載玻片上滴加一滴（約40μl）免洗DAPI液，解剖顯微鏡下鋪片后，將蓋玻片倒扣于載玻片上。

1.2.3激光共聚焦顯微鏡成像

將耳蝸基底膜鋪片置于激光共聚焦顯微鏡（Zeiss780，德國(guó)）100×油鏡下觀察，選擇激發(fā)光波長(zhǎng)分別為358nm和488nm。觀察基底膜中回區(qū)域的內(nèi)外毛細(xì)胞，并在所選區(qū)域?qū)γ?xì)胞從上至下進(jìn)行掃描，對(duì)標(biāo)本各層圖像進(jìn)行連續(xù)觀察，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的掃描層距為0.3μm。

1.2.4小鼠ABR測(cè)聽(tīng)

采用美國(guó)TDT測(cè)聽(tīng)設(shè)備，Biosig測(cè)聽(tīng)軟件對(duì)小鼠進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)。測(cè)聽(tīng)在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，測(cè)聽(tīng)前使用1%戊巴比妥鈉（9μl/g，腹腔注射）對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于小鼠兩側(cè)耳廓前緣連線顱頂中點(diǎn)皮下，參考電極置于測(cè)試耳后皮下，接地電極置于對(duì)側(cè)耳后皮下，測(cè)試耳機(jī)距外耳道口約0.5cm，檢測(cè)小鼠雙耳的ABR閾值。實(shí)驗(yàn)采用短聲（Click）和短純音（Toneburst，Rise/Fall time:1ms；Duration:4ms）作為刺激聲，帶通濾波為300～3000Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時(shí)間10ms。刺激聲強(qiáng)度自90dBSPL開(kāi)始，以10dB逐漸遞減，直至檢測(cè)不出重復(fù)的ABR波形，再向上增強(qiáng)5dB，直至能檢測(cè)出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強(qiáng)度即為小鼠的聽(tīng)閾。

2 結(jié)果

出生后0d，內(nèi)外毛細(xì)胞上均可見(jiàn)突觸帶信號(hào)，且在內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)和基底側(cè)膜上可見(jiàn)不均一散在信號(hào)，（18.4±2.3）個(gè)/IHC（圖1和3 0d）；外毛細(xì)胞則可見(jiàn)少許信號(hào)及部分細(xì)胞未見(jiàn)信號(hào)，（1.6±0.9）個(gè)/ OHC（圖2和3 0d）。出生后3d至6d，毛細(xì)胞上信號(hào)數(shù)目逐漸增多，胞質(zhì)中仍可見(jiàn)多量信號(hào)分布，且在第6d時(shí)達(dá)高峰，（35.1±3.4）個(gè)/IHC和（21.0±3.2）個(gè)/ OHC（圖3 6d）。出生后12d、30d和60d，突觸帶信號(hào)逐漸移向毛細(xì)胞的基底側(cè)膜，且信號(hào)數(shù)量上也趨于穩(wěn)定（圖1,2和3a）。相比內(nèi)毛細(xì)胞，外毛細(xì)胞上突觸帶數(shù)目經(jīng)歷著更為劇烈的變化。圖4所示為鼠齡12d時(shí)click聲刺激所誘發(fā)的ABR波形和聽(tīng)覺(jué)發(fā)生的平均時(shí)間13.2天。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)，內(nèi)毛細(xì)胞突觸帶的數(shù)目及分布情況。綠色為突觸帶信號(hào)，藍(lán)色為內(nèi)毛細(xì)胞胞核。出生后0d至6d，突觸帶數(shù)量上逐漸增多，并在第6d時(shí)達(dá)高峰。6d至12d后,突觸帶急劇減少并趨于穩(wěn)定。白色箭頭示0d至6d在內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)上可見(jiàn)散在突觸帶信號(hào)分布，12d、30d和60d時(shí)已逐漸移向基底側(cè)膜。Fig.1 Number and distribution of synaptic ribbon in IHCs at different time points.Green for the synaptic ribbon signals, blue for the IHC nucleus.At 0d to 6d after birth,the number of synaptic ribbon gradually increased,and reached the peak at 6d.Then,the number of synaptic ribbon decreased sharply and tended to be stable at6d to 12d.White arrows showed the signal can be observed sporadically in cytoplasm at0d to 6d., the signal gradually moved to the basolateral membrane at 12d,30d and 60d.

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)，外毛細(xì)胞突觸帶的數(shù)目變化。綠色為突觸帶信號(hào)，藍(lán)色為外毛細(xì)胞胞核。出生0d至6d，外毛細(xì)胞的信號(hào)逐漸增多，在6d時(shí)達(dá)高峰；6d至12d時(shí)，信號(hào)數(shù)目急劇減少；12d、30d和60d時(shí)信號(hào)數(shù)目趨于穩(wěn)定，1-3個(gè)/外毛細(xì)胞。Fig.2 Changes in the number of synaptic ribbon in OHCs at different time points.Green for the synaptic ribbon signal, blue for the OHC nucleus.The signal number of the OHCs gradually increased from 0d to 6d,and reached the peak at6d. Subsequently,the number of signals decreased sharply from 6d to 12d.Finally,the number of signals tended to be stable, and 1-3/OHC,at12d,30d and 60d.

圖3 a)隨時(shí)間改變，內(nèi)、外毛細(xì)胞突觸帶數(shù)目的變化趨勢(shì)。0d至6d時(shí)，信號(hào)數(shù)目逐漸增多，并于6d時(shí)達(dá)高峰；6d至12d時(shí)急劇減少；12d后，內(nèi)、外細(xì)胞突觸帶數(shù)目趨于穩(wěn)定。b)相對(duì)于出生60d時(shí)內(nèi)、外毛細(xì)胞上突觸帶的變化趨勢(shì)，提示出生早期外毛細(xì)胞上的突觸帶數(shù)目經(jīng)歷著更為劇烈的變化。Fig.3 a)Changes in the number of synaptic ribbon in IHCs and OHCs over time.From 0d to 6d,the number of signals gradually increased,and reached a peak at 6d.Then,a sharp reduction happened from 6d to 12d.Subsequently,the number of synapse ribbon in IHCs and OHCs tended to be stable. b)The changes compared w ith 60d after birth of synaptic ribbon in IHCs and OHCs,suggesting that the number of synaptic ribbon in OHCsunderwentmore dramatic changes.

圖4 a).Click聲刺激下誘發(fā)的12d鼠齡的ABR波形。b).C57小鼠聽(tīng)力出現(xiàn)時(shí)間的分布情況，平均聽(tīng)覺(jué)出現(xiàn)時(shí)間是出生后13.2d。Fig.4 a)The ABRwaveform of 12-day-oldmice induced by“Click”acoustic stimulation.b)The distribution of hearing onset time in C57m ice,and the average timewas at13.2d afterbirth.

3 討論

耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸是聲音信號(hào)傳導(dǎo)通路上的第一個(gè)突觸結(jié)構(gòu)，其在聲音信號(hào)編碼和傳導(dǎo)過(guò)程中的作用已越來(lái)越引起關(guān)注和重視。但由于該突觸結(jié)構(gòu)所在位置隱蔽，且體積微?。▽儆诩{米級(jí)別，直徑范圍波動(dòng)于100～200nm），致使其研究困難。近年來(lái)，隨著帶狀突觸前膜突觸帶結(jié)構(gòu)成分的確定，國(guó)內(nèi)外已逐漸棄用透射電鏡并開(kāi)始采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡來(lái)研究耳蝸帶狀突觸的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且功能更強(qiáng)的共聚焦顯微鏡可進(jìn)行層距十分微小的光學(xué)掃描（約0.3μm）并進(jìn)行三維信號(hào)重建，可達(dá)計(jì)數(shù)和定位的目的。在本研究中，我們利用免疫熒光標(biāo)記結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察的方法來(lái)顯示毛細(xì)胞突觸帶結(jié)構(gòu)，直觀、定量觀察突觸帶在空間分布和數(shù)目上的時(shí)域變化特點(diǎn)。

研究表明，RIBEYE是毛細(xì)胞突觸帶結(jié)構(gòu)的主要組成部分，借助短絲帶（Short filament）呈棒狀垂直連接于內(nèi)毛細(xì)胞基底側(cè)膜的活動(dòng)區(qū)（Active zone），并與軸突末梢形成突觸[11]。結(jié)構(gòu)上含有Do?mainA和DomainB兩部分，其中DomainA為其特異性結(jié)構(gòu)，具有酶活性，介導(dǎo)RIBEYE聚合成更大的分子結(jié)構(gòu)；DomainB則與胞核內(nèi)2-羥基酸脫氫酶相關(guān)的阻遏蛋白Ctbp2的結(jié)構(gòu)相同[12]。因此，本研究中使用的Ctbp2抗體可以和DomainB特異性結(jié)合的同時(shí)也可使內(nèi)毛細(xì)胞的胞核著色（圖1 30d和60d），從而實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記突觸帶。

本研究結(jié)果顯示，C57小鼠在出生時(shí)內(nèi)、外毛細(xì)胞上即可觀察到標(biāo)記的突觸帶，該信號(hào)呈大小不等圓點(diǎn)狀不均一分布于內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)和基底側(cè)膜上（圖1 0d），在外毛細(xì)胞則可見(jiàn)少許數(shù)目信號(hào)，部分細(xì)胞未見(jiàn)信號(hào)存在，提示突觸帶的出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞上早于外毛細(xì)胞。對(duì)與突觸帶相對(duì)的突觸后膜上有關(guān)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，剛出生小鼠耳蝸底轉(zhuǎn)的螺旋神經(jīng)元傳入軸突末梢上的突觸后致密斑與突觸帶相靠近[13]。運(yùn)用免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)出生時(shí)GluR2/R3 AMPA受體即已存在[14]，但此時(shí)小鼠尚無(wú)聽(tīng)力，表明出生時(shí)突觸連接結(jié)構(gòu)即已成功建立，然該連接功能上尚不成熟，不具信息傳遞功能。隨著突觸的發(fā)育，我們發(fā)現(xiàn)C57小鼠在聽(tīng)力出現(xiàn)前，突觸前結(jié)構(gòu)的數(shù)目與分布在內(nèi)、外毛細(xì)胞上呈動(dòng)態(tài)變化，出生后數(shù)目逐漸增多，第6d達(dá)高峰。尤其是外毛細(xì)胞上的突觸帶的數(shù)量，數(shù)目可達(dá)18-22個(gè)/細(xì)胞（圖1和2 6d）。對(duì)于毛細(xì)胞上突觸帶一過(guò)性增長(zhǎng)的現(xiàn)象，Echteler和Huang等認(rèn)為，可能與出生初期大量螺旋神經(jīng)元傳入纖維分叉，發(fā)出的軸突非選擇性支配內(nèi)、外毛細(xì)胞形成大量不成熟的帶狀突觸有關(guān)[14-16]。至出生后第12、30和60d，C57小鼠聽(tīng)力開(kāi)始出現(xiàn)（圖4）并逐漸趨向成熟。與此同時(shí)，突觸帶的數(shù)目也逐漸趨于穩(wěn)定，空間分布上也由散在游離于胞質(zhì)移向毛細(xì)胞的基底側(cè)膜。從出生后第6d至12d，我們定量分析了突觸帶數(shù)目上的變化，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細(xì)胞上減少約50%，而外毛細(xì)胞上則發(fā)生著更為劇烈的變化，減少約1000%（圖3）。數(shù)目上的巨大變化，不少學(xué)者認(rèn)為這是由于I型螺旋神經(jīng)元軸突分支的回縮（Retraction）、修剪（Pruning）、精減（Refinement）和圓形突觸前帶相互融合成細(xì)長(zhǎng)型及多余II型螺旋神經(jīng)元發(fā)生凋亡，使得許多不成熟連接消除所致[14,16-18]。同樣地，出生早期突觸后膜上的GluR2/3 AMPA受體的變化特點(diǎn)也發(fā)生著與突觸前膜上突觸帶類似的變化[14]。位置上的變化，被認(rèn)為同突觸帶的錨鏈蛋白Bassoon的表達(dá)密切相關(guān)[19]。因此，對(duì)突觸帶的單一標(biāo)記，也可較準(zhǔn)確地反映毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)之間連接的變化，由于是單通道掃描，突觸數(shù)目也方便計(jì)算。此外，為了驗(yàn)證毛細(xì)胞突觸帶形態(tài)上的成熟是否對(duì)應(yīng)小鼠聽(tīng)力的發(fā)生，我們檢測(cè)C57小鼠聽(tīng)覺(jué)發(fā)生的平均時(shí)間是13.2d（圖4b），與突觸帶數(shù)目和空間分布穩(wěn)定出現(xiàn)的時(shí)間基本一致，表明成熟突觸帶對(duì)聽(tīng)覺(jué)的發(fā)生至關(guān)重要。然而，關(guān)于突觸帶結(jié)構(gòu)在C57小鼠出生早期所呈現(xiàn)的時(shí)域變化特點(diǎn)其分子機(jī)制和生理意義目前尚不清楚，猜測(cè)可能以某種方式影響了螺旋神經(jīng)元軸突或毛細(xì)胞的成熟，為快速、高效的聽(tīng)覺(jué)信息傳遞提供堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

綜上，我們的結(jié)果顯示相比內(nèi)毛細(xì)胞，外毛細(xì)胞上一過(guò)性突觸連接的變化及突觸帶空間分布上的改變更為劇烈（圖3b），毛細(xì)胞上的突觸帶在出生時(shí)即已存在，出生后才逐漸發(fā)育和完善，與聽(tīng)覺(jué)發(fā)生時(shí)間上的高度吻合，提示成熟的突觸帶是聽(tīng)覺(jué)發(fā)生的前提條件之一。

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Observation of developmental changesof hair cellsynaptic ribbons in C57m ice

YANGLe1，4,LIUKe2,YANGShiming3,GONGPinggui4,LIU Junyi1,ZHNAGJunjun1,WANGXuemei1,PENGHong11 Southern MedicalUniversity,Guangzhou 510515,China;
2DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,Friendship Hospitalaffiliated to CapitalMedicalUniversity, Beijing 100050,China;
3DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100039,China;
4DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,Guangdong Second ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou 510310,China

PENGHong Email:doctorpenghong@163.com

Objective To investigate the temporal characteristicsof developmentof the synaptic ribbon in cochlear hair cells in C57m ice.M ethods The number and distribution of presynaptic ribbonson thewhole cochlearbasilarmembranewere exam ined and recorded by confocalm icroscopy w ith immunofluorescence in C57m ice atdifferent developmental stages.ABRswere used to detect the time of hearing onset.Results Ctbp2 signalswere present in the cytoplasm of inner and outer hair cells at day 0,continuing increasing at day 3 and reaching peak values(35.1±3.4/inner hair cell and 21.0±3.2/outer hair cell)at day 6.Subsequently,Ctbp2 signals tended to stabilize at16-20/inner hair cell and 1-3/ outer hair cell,w ith a gradual distribution shift to the basolateralwallof hair cells.In addition,ABR tests suggested that the average time of hearing onset in C57m icewas 13.2 days.Conclusions Synaptic ribbons in hair cells are presentat birth,and continue to develop andmature after birth.The seemingly synchronized developmentof hearing andmatura-tion of synaptic ribbonssuggest that the lattermay bea pre-condition for the former.

Hair cells;Synaptic ribbon;Development;Hearing onset

R764

A

1672-2922（2017）02-234-5

2017-02-11審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.018

國(guó)家自然科學(xué)基金（81572666）

楊樂(lè)，碩士，研究方向：耳顯微外科

楊樂(lè)和柳柯為并列第一作者

姓名:彭宏，Email:doctorpenghong@163.com