呂哲 張穎 張玉波 時(shí)美娟 孟晴 路虹

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科（石家莊050000）

大鼠局灶性腦缺血再灌注后聽(tīng)覺(jué)中樞損傷的研究

呂哲 張穎 張玉波 時(shí)美娟 孟晴 路虹

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科（石家莊050000）

目的探討大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后聽(tīng)覺(jué)中樞的改變及引起聽(tīng)力損傷的可能機(jī)制。方法選擇健康白色雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組和缺血再灌注組，每組30只。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，假手術(shù)組只分離頸部血管，不插入線栓。腦缺血60min，再灌注24h。于手術(shù)前及術(shù)后24h檢測(cè)聽(tīng)性腦干反應(yīng)，術(shù)后24h行神經(jīng)功能評(píng)分，干濕重法測(cè)定腦組織含水量，TTC法檢測(cè)腦梗死體積，通過(guò)Evans blue的滲出情況評(píng)估血腦屏障的完整性，末端標(biāo)記法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況，計(jì)算凋亡指數(shù)。Western blotting法測(cè)定MMP-9、Clau?din-5、Occludin、PSD-95、CX-43及Na+-α蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量升高，腦梗死體積增大，ABR反應(yīng)閾值明顯增加，凋亡指數(shù)增加，MMP-9、CX-43蛋白表達(dá)明顯上升，Claudin-5、Occludin、PSD-95、Na+-α蛋白表達(dá)顯著下降。兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論局灶性腦缺血再灌注損傷后聽(tīng)覺(jué)中樞的改變及聽(tīng)力損傷可能與MMPs激活、血腦屏障破壞、縫隙連接通道功能活化、突觸功能異常及離子通道破壞有關(guān)。

缺血再灌注損傷；血腦屏障；縫隙連接；金屬蛋白酶9；離子通道

聽(tīng)力障礙嚴(yán)重影響一個(gè)人的生活質(zhì)量和社會(huì)交往，許多原因都可導(dǎo)致聽(tīng)力障礙，例如炎癥、外傷、老齡化、遺傳及腦梗塞。許多臨床報(bào)告都顯示腦卒中患者伴有聽(tīng)力損害[1-2]，但是其具體機(jī)制研究尚少。

既往對(duì)缺血再灌注損傷導(dǎo)致聽(tīng)力損傷研究多集中于耳蝸，對(duì)其導(dǎo)致的中樞病變研究較少[3-6]。腦梗塞后可出現(xiàn)聽(tīng)覺(jué)處理異常[7]。同樣有許多腦梗塞伴聽(tīng)力損傷患者顯示有聽(tīng)覺(jué)感知如聲音定位的障礙，用外周病變很難解釋。聽(tīng)皮層是大腦皮質(zhì)的一個(gè)亞皮質(zhì)區(qū)域，也是聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的最高級(jí)中樞。初級(jí)聽(tīng)皮層神經(jīng)元的凋亡及退行性變將導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)中樞對(duì)傳入聲音信息的感知能力下降，對(duì)聲音信息的處理和認(rèn)知能力下降[8]。神經(jīng)信號(hào)發(fā)生和傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)與縫隙連接、化學(xué)突觸及離子通道有關(guān)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流。在本研究中，我們通過(guò)建立短暫性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，探討腦缺血導(dǎo)致聽(tīng)力障礙的可能機(jī)制，以及聽(tīng)覺(jué)皮層損傷是否與激活MMP-9、細(xì)胞凋亡，破壞縫隙連接、突觸及血腦屏障，進(jìn)而影響中樞聽(tīng)覺(jué)功能有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康白色雄性SD大鼠60只，耳廓反射靈敏、無(wú)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250-280g，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，恒溫20-25℃，12h光照/12h黑暗環(huán)境飼養(yǎng)。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2試劑和儀器

三苯氯化四氮唑（TTC）、兔抗CX43單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗Na+-α單克隆抗體、兔抗PSD-95多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗Claudin-5多克隆抗體、兔抗Occludin多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體、Evans blue（美國(guó)Santa Cruz公司），Tunel試劑盒（Roche公司），羊抗兔IgG熒光抗體（美國(guó)Rockland公司），ICS-CHARTR-EP型ABR電位儀（北京麥德森醫(yī)療器），Synergyynergy-HT多功能酶標(biāo)（美國(guó)BioTek公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組和模型：將SD大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（Sham組）和缺血再灌注組（Ischemia-Re? perfusion，I/R組）。每組30只。具體方法為：大鼠以10%水合氯醛麻醉后，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，于頸外動(dòng)脈上用顯微手術(shù)剪剪一小口，將標(biāo)記好的栓線由切口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈，向上深入約為距頸總動(dòng)脈分叉處18.5±0.5mm，進(jìn)線有輕微阻力，堵住大腦中動(dòng)脈開(kāi)口。結(jié)扎固定。閉塞時(shí)間為60min，后輕柔拔出線栓[9]。Sham組只分離頸部血管，不插入線栓。缺血再灌注24h后進(jìn)行檢測(cè)和處死、取材。

1.3.2神經(jīng)功能缺失評(píng)分：處死前采用改良的Lon?ga的6級(jí)5分法單盲進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分[9]。0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：提尾時(shí)不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2分：提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分：行走時(shí)輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分：行走時(shí)嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分：不能自發(fā)行走，向?qū)?cè)跌倒。

1.3.3聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response, ABR）測(cè)試：造模前及造模后24小時(shí)后，對(duì)兩組動(dòng)物進(jìn)行右耳ABR檢測(cè)。具體方法為：10%水合氯醛（0.35m l/100g）腹腔注射麻醉，置于隔聲屏蔽室內(nèi)，采用美國(guó)ICS聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位儀檢測(cè)，使用針式電極，記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于右耳耳廓皮下，接地電極置于鼻尖。選用短聲為刺激聲，極性為交替波，速率為21.1次／秒，增益為50k，觀察時(shí)程為10ms。初始刺激強(qiáng)度從90dB SPL開(kāi)始，后按5dB SPL逐檔遞減。至遞減到出現(xiàn)兩次ABR波Ⅲ波形不一致時(shí),再增加5dBSPL檢測(cè)。直至重復(fù)波形出現(xiàn)一致時(shí),即記為ABR反應(yīng)閾值。為減少人為誤差，同樣方法再次測(cè)試，兩次Ⅲ波重合即可確定為閾值。

1.3.4腦組織含水量測(cè)定：大鼠斷頭快速取腦，冠狀切開(kāi)去除額極。取病變側(cè)約2mm厚腦組織，放入已稱重的錫紙中稱重。然后用錫紙包裹，放入95℃烤箱中烘干24h，取出恢復(fù)至室溫稱重。采用公式計(jì)算腦組織含水量：（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%。

1.3.5腦梗死體積測(cè)定：大鼠斷頭迅速取腦，PBS沖洗，均勻切成5片冠狀切片，浸入2%TTC溶液中，37℃溫箱中染色30min，4%多聚甲醛固定24h，拍照后應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算梗死體積。梗死體積百分比=[總梗死體積-（梗死側(cè)半球體積-梗死對(duì)側(cè)半球體積）]/梗死對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.3.6 Evans blue含量測(cè)定：大鼠處死前2h經(jīng)尾靜脈緩慢注射2%Evansblue溶液（4m l/kg），2h后10%水合氯醛麻醉，PBS心臟灌注，經(jīng)血液循環(huán)將腦組織中其它部位的Evansblue溶液沖洗掉。斷頭取腦并拍照，收集損傷側(cè)大腦半球并稱重，用50%三氯乙醇做為勻漿介質(zhì)進(jìn)行勻漿（1.5ml/g腦組織）。取上清液，室溫靜置10min后4℃3000g離心20min。冰上靜置10min后將上面的液體完全取出，無(wú)水乙醇稀釋（液體：無(wú)水乙醇=1：3）混勻，酶標(biāo)儀上620nm處測(cè)量吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照后計(jì)算Ev?ansblue含量（ug/g腦組織）

1.3.7 TUNEL法檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞:麻醉后暴露心臟，自心尖處插入灌注針，以4%多聚甲醛灌注后取腦。參照《大鼠腦立體定位圖譜》確定聽(tīng)皮層區(qū)域并于顯微鏡下剝離皮層組織取材。置于4%多聚甲醛中固定24小時(shí)以上，石蠟包埋。按照大鼠的冠狀位進(jìn)行切片，5um/片，從聽(tīng)皮層開(kāi)始到最后，每5張腦片選擇一張，常規(guī)脫蠟至水，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，光鏡下觀察，細(xì)胞核內(nèi)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。分別隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算凋亡指數(shù)：AI=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

1.3.8 Western-blotting檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（Ma?trixmetalloproteinase-9，MMP-9）、緊密連接蛋白-5（Claudin-5）、閉鎖蛋白（Occludin）、突觸后密度蛋白95（postsynaptic density protein-95,PSD-95）、連接蛋白43（Connexin-43，CX-43）、鈉離子通道α（Na+-α）蛋白表達(dá)：顯微鏡下取梗死側(cè)聽(tīng)皮層腦組織，制備腦組織勻漿，12000r/min4℃離心30min后取上清，BCA法蛋白定量。后經(jīng)變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入兔抗MMP-9多克隆抗體（1：400）、兔抗Claudin-5多克隆抗體（1：400）、兔抗Occludin多克隆抗體（1：500）、兔抗PSD-95多克隆抗體（1：500）、兔抗CX43單克隆抗體（1：400）、兔抗Na+-α單克隆抗體（1：400）、兔抗β-actin多克隆抗體（1：500），4℃孵育過(guò)夜后洗膜，加入羊抗兔IgG熒光抗體（1：3000），37℃孵育1h，遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描，測(cè)定目標(biāo)帶單位密度，以β-actin的表達(dá)為內(nèi)參照，MMP-9/β-actin、Claudin-5/β-actin、Occludin/β-actin、PSD-95/ β-actin、CX-43/β-actin、Na+-α/β-actin比值代表各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦組織含水量和腦梗死體積比較

Sham組無(wú)行為學(xué)改變，腦組織經(jīng)TTC染色后顯示出均勻的紅色(圖1)。與Sham組比較，I/R組則表現(xiàn)出不同程度的腦缺血性損傷的表現(xiàn)，例如不同程度的前肢屈曲，轉(zhuǎn)圈，對(duì)側(cè)肢體癱瘓等癥狀，表明缺血再灌注后造成了明顯的神經(jīng)功能缺損。用干濕重法測(cè)得到腦組織含水量顯示，I/R組病變側(cè)腦組織含水量明顯升高；病變側(cè)腦組織經(jīng)TTC染色后顯示為大范圍蒼白色梗死區(qū)域(圖1)。兩組神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦組織含水量和腦梗死體積比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1、圖1）。

圖1 Sham組和I/R組TTC染色Fig.1 The TTCStaining of Sham and I/R groups

表1 I/R 24h后兩組神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量、腦梗死體積、腦組織EB含量及凋亡指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s）Table 1 The Resultof neurologicalscores、water content、infarctvolume、EBContentsand AIat24hrs post-operation（±s）

表1 I/R 24h后兩組神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量、腦梗死體積、腦組織EB含量及凋亡指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s）Table 1 The Resultof neurologicalscores、water content、infarctvolume、EBContentsand AIat24hrs post-operation（±s）

Groups Sham group I/R group tP Neurological Scores（n=30）0 3.60±0.55 -35.851 <0.001 Water Contentof Brain（%）（n=5）75±2.45 83.60±3.36 -4.6244 =0.002 InfarctVolume（%）（n=5）0 61.80±2.39 -57.8197 <0.001 EB Contents（ug/g）（n=5）0.74±0.02 3.46±0.04 -136 <0.001 AI(%)（n=5）3.4±1.5 41.6±3.3 -23.5641 <0.001

2.2 ABR反應(yīng)閾

造模前兩組ABR反應(yīng)閾分別為24.38±4.35和24.88±3.85dB SPL，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后分別為24.88±3.85和55.60±3.36dBSPL。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01。Sham組造模前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I/R組造模前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示聽(tīng)力嚴(yán)重?fù)p傷。（表2、圖2）

圖2 Sham組和I/R組ABR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 TheABRRssultof Sham and I/R groups(A:Sham group；B:I/R group)

2.3 Evansblue含量測(cè)定

缺血再灌注后24h，通過(guò)測(cè)量酶標(biāo)儀上吸光度來(lái)檢測(cè)腦組織中Evans blue的漏出量來(lái)評(píng)估BBB的完整性，結(jié)果顯示，I/R組缺血側(cè)Evansblue滲漏較Sham組明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）（表1、圖3）。

圖3 Evansblue染色A:Sham組；B:I/R組Fig.3 The Evansblue Staining of Sham and I/R groups(A:Sham group；B:I/R group)

2.4 TUNEL法檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞

TUNEL法可以原位特異性的顯示檢測(cè)凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示缺血再灌注后24h，I/R組病變側(cè)梗死灶周邊組織陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，兩組AI比較為41.6±3.3%vs 3.4±1.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。細(xì)胞形態(tài)上有改變，例如核濃縮，DNA片段化，凋亡小體等，提示缺血再灌注可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生（表1、圖4）。

圖4 神經(jīng)細(xì)胞Tunel染色（×200）A：Sham組；B：I/R組；Fig.4 The TunelStaining ofneuralcells（×200）(A:Sham group；B:I/R group)

2.5 MMP-9、Claudin-5、Occludin、PSD-95、CX-43、Na+-α蛋白表達(dá)

Sham組皮層腦組織中有少量MMP-9蛋白表達(dá)，大量Claudin-5、Occludin、PSD-95、Na+-α蛋白表達(dá)。I/R組缺血皮層MMP-9、CX-43蛋白表達(dá)明顯上升，Claudin-5、Occludin、PSD-95、Na+-α蛋白表達(dá)顯著下降，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）（圖5、圖6、圖7）。

圖5 Western-blotting檢測(cè)MMP-9和CX-43蛋白表達(dá)A、B：MMP-9；C、D：CX-43*P<0.01vs Sham組Fig.5 The Protein Expression of MMP-9 and CX-43 by Wesern-blotting(A、B：MMP-9；C、D：CX-43),*P<0.01vs Sham group

表2 兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右耳ABR檢測(cè)結(jié)果（±s，n=30，dBSPL）Table2 TheABRResultof the RightEarof two Groups（±s，n=30，dBSPL）

表2 兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右耳ABR檢測(cè)結(jié)果（±s，n=30，dBSPL）Table2 TheABRResultof the RightEarof two Groups（±s，n=30，dBSPL）

Groups Sham group I/R group t P Pre-operation 24.38±4.35 24.88±3.85 -0.4714 >0.05 24hrspost-operation 26.44±5.45 55.60±3.36 -24.9458 <0.001 -1.6180 -32.9277 >0.05 <0.001 tP

圖6 Western-blotting檢測(cè)Claudin-5和Occludin蛋白表達(dá)A、B：Claudin-5；C、D：Occludin*P<0.01vs Sham組Fig.6 The Protein Expression of Claudin-5 and Occludin by Western-blotting(A、B：Claudin-5；C、D：Occludin),*P< 0.01vs Sham group

圖7 Western-blotting檢測(cè)PSD-95和Na+-α蛋白表達(dá)A、B：PSD-95；C、D：Na+-α*P<0.01vs Sham組Fig.7 The Protein Expression of PSD-95 and Na+-αbyWestern-blotting(A、B：PSD-95；C、D：Na+-α),*P<0.01vs Sham group

3 討論

腦缺血再灌注后可以引發(fā)一系列復(fù)雜的分子學(xué)和生化機(jī)制，包括細(xì)胞凋亡、血腦屏障、基質(zhì)金屬蛋白酶激活、縫隙連接、突觸異常、離子通道開(kāi)放等。這幾種因素相互作用，構(gòu)成一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，造成系列病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。我們應(yīng)用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注損傷（I/R）模型，手術(shù)操作簡(jiǎn)便，創(chuàng)傷小，可良好模擬人類大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血狀態(tài)。I/R后通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量及梗死體積測(cè)定提示大腦皮質(zhì)損傷。對(duì)聽(tīng)覺(jué)通路高級(jí)中樞聽(tīng)皮層的進(jìn)一步檢測(cè)提示神經(jīng)元出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化，本研究實(shí)驗(yàn)組在缺血再灌注24h后ABR反應(yīng)閾較Sham組顯著升高，說(shuō)明外周聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)至腦干通路的神經(jīng)電活動(dòng)異常，聽(tīng)功能出現(xiàn)損害，提示在腦卒中大鼠存在著聽(tīng)力損害。

BBB是維持并穩(wěn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的重要結(jié)構(gòu)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間緊密連接（tight junction，TJ）是BBB的核心結(jié)構(gòu)。Claudin-5及Oc?cludin是構(gòu)成TJ的主要蛋白。腦缺血時(shí)可以激活炎性細(xì)胞因子，如NF-κB、IL-6等，促進(jìn)與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[11]。NF-κB還可以調(diào)節(jié)某些促炎性基因如MMP-9的表達(dá)。腦缺血再灌注后激活的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞以及浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞均能釋放MMP-9。而MMP-9可以攻擊TJ蛋白和毛細(xì)血管基底膜，導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)、血管源性水腫及BBB開(kāi)放。同時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生大量氧自由基，增加興奮性氨基酸釋放，增強(qiáng)血腦屏障的通透性[12]。吳捧蓮等[13]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后MMP-9表達(dá)升高，claudin-5表達(dá)降低，而PJ34可以通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)，增加claudin-5表達(dá)來(lái)維持血腦屏障通透性，對(duì)I/R損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。Zehendner等[14]報(bào)導(dǎo)凋亡會(huì)通過(guò)降解occludin和Claudin-5而致TJ蛋白改變。與上述所有研究一樣，我們也發(fā)現(xiàn)腦缺血時(shí)MMP-9蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明MMP-9積極參與了缺血的病理過(guò)程。I/R后通過(guò)Tunel染色發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞增多，Occludin及Clau?din-5蛋白表達(dá)顯著下降。Occludin及Claudin-5表達(dá)減少使微血管完整性破壞，從而使BBB破壞，并可使缺血后大腦炎癥細(xì)胞因子滲透入腦[15]。結(jié)合Evansblue染色及含量測(cè)定結(jié)果，提示微血管完整性破壞，BBB破壞。

細(xì)胞連接是細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的一些特化的連接裝置。神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)縫隙連接(gap junction，GJ)及化學(xué)突觸進(jìn)行神經(jīng)信息傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流。神經(jīng)細(xì)胞缺血后可通過(guò)GJ以“鈣波”形式改變周?chē)?xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而使缺血損傷蔓延[16]。研究表明，抑制GJ功能可以減輕腦缺血再灌注損傷[17]。腦組織中分布最廣泛的是CX43蛋白?；罨蟮男切文z質(zhì)細(xì)胞通過(guò)CX43半通道釋放一系列物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，釋放更多的炎癥物質(zhì)和其它物質(zhì)促進(jìn)神經(jīng)元死亡[18]。突觸是神經(jīng)元之間信息交流的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，神經(jīng)元突觸對(duì)腦缺血損傷極為敏感，可以導(dǎo)致突觸數(shù)目、結(jié)構(gòu)及功能的變化，進(jìn)而直接影響神經(jīng)信息的傳遞。PSD95是突觸后致密物中的主要蛋白，與突觸活動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及離子通道有關(guān)。研究表明腦缺血時(shí)PSD95直接參與了缺血信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，PSD95的改變直接影響突觸的傳遞功效，對(duì)突觸功能和神經(jīng)元存活有明顯影響[19-20]。我們的研究同樣也證實(shí)了I/R后CX43蛋白表達(dá)明顯升高，PSD-95蛋白表達(dá)顯著降低，提示腦缺血后縫隙連接通道功能活化和突觸功能異常。

離子通道是神經(jīng)信號(hào)發(fā)生和傳遞的基本單元，并可影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、興奮性突觸后電位等。神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)它們進(jìn)行神經(jīng)信息傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流。鈉通道是由α,β亞基組成的跨膜糖蛋白，鈉電流可引起細(xì)胞的去極化和傳導(dǎo)興奮，是細(xì)胞動(dòng)作電位產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。缺氧時(shí)Na+內(nèi)流持續(xù)增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+增多，引起繼發(fā)性鈣超載、興奮性氨基酸和自由基釋放增加，以及水和氯離子內(nèi)流并使細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和壞死的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]。我們的研究證實(shí)I/R后Na+-α蛋白表達(dá)降低，提示Na+介導(dǎo)的電流中斷或失活，這可能是缺血后聽(tīng)力損傷的可能機(jī)制之一。

因此，我們推測(cè)，在腦缺血再灌注導(dǎo)致聽(tīng)皮層損傷及聽(tīng)力受損的過(guò)程中，腦缺血激活炎性細(xì)胞因子及神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞后，MMP-9表達(dá)上調(diào)，TJ蛋白和毛細(xì)血管基底膜破壞，BBB滲透性增加。同時(shí)缺血再灌注影響細(xì)胞周?chē)}離子濃度及興奮性氨基酸的釋放，影響細(xì)胞之間的縫隙連接、突觸及離子通道，進(jìn)一步影響神經(jīng)信息傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，聽(tīng)覺(jué)的形成是非常復(fù)雜的過(guò)程，ABR異常結(jié)果有可能受到其他因素影響，缺血對(duì)耳蝸的血供影響，血管紋、毛細(xì)胞等的異常，也會(huì)對(duì)ABR的閾值異常產(chǎn)生影響，聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的改變單獨(dú)用中樞或外周器官聽(tīng)覺(jué)器官的損傷或結(jié)構(gòu)改變來(lái)解釋并不能得到滿意的答復(fù)。腦缺血再灌注后聽(tīng)力損傷，其機(jī)制是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多途徑、多因素的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，每種因素并非是單獨(dú)存在，而是相互影響或互為因果。本研究只是對(duì)腦缺血再灌注后聽(tīng)皮層的神經(jīng)元的病理變化進(jìn)行了初步探討，對(duì)于外周器官的變化，如耳蝸、毛細(xì)胞等等變化并未進(jìn)行觀察，同時(shí)對(duì)于缺血再灌注后ABR不同頻率的聽(tīng)閾、潛伏期改變及中樞傳導(dǎo)時(shí)間變化并未進(jìn)行檢測(cè)，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

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Auditory center injury after focalcerebral ischem ia-reperfusion injury in RATS

LVZhe,ZHANGYing,ZHANGYubo,SHIMeijuan,MENGQing,LUHong
DepartmentofOtolaryngology,Second HospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050000,China

LUHong Email:wx_900804@163.com

Objective To investigate themechanism of auditory center injury and hearing loss after focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats.M ethods Sixty healthy male adult SD rats were random ly divided into an ischemia-reperfusion(I/R)group and a sham operation group(n=30 in each group).For rats in the I/R group,themiddle cerebral artery occlusion(MCAO)modelwas established by suturing,w ith ischemia for 60mins followed by reperfusion for 24 hrs;while for those in the control group,only cervical vessels isolation was performed w ith no thread embolism inserted.The auditory brainstem response(ABR)was tested before and at24 hrs after operation,respectively.At24 hrs post-operation,neurological function,changes of water content in the brain(using dry-wetweightmethod)and infarct volume(using TTCmethod)weremeasured.The integrity of blood-brain barrier(BBB)was also evaluated by view ing exudation of Evans blue,and apoptosis of neurocyteswas exam ined by TUNEL to determ ine the apoptotic index(AI). Expression of MMP-9,Claudin-5,Occludin,PSD-95,CX-43 and Na+-αprotein were tested by Western blotting.Results Compared w ith the sham operation group,neurological function scores,infarct volume and water contentof brain were higherw ith elevated ABR thresholdsand AIin the I/R group.Expression ofMMP-9 and CX-43 proteinwas significantly up-regulated,while expression of Claudin-5,Occludin,PSD-95 and Na+-αprotein was significantly down-regulated.Conclusions Themechanism of hearing loss after focal cerebral ischem ia-reperfusion injury is perhaps related to MMPsactivation,BBB damage,gap junction activation,synaptic dysfunction and destruction of ion channels.

Ischemia-reperfusion injury；Blood-brain barrier；Gap junction；Matrix metalloproteinase-9；Ion channels

R764

A

1672-2922（2017）02-222-7

2017-02-02審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.016

呂哲,碩士,副主任醫(yī)師,耳聾及眩暈的基礎(chǔ)和臨床研究

路虹,Email:wx_900804@163.com