王敏 王保龍 周明 完曉菊 廖艷秋

·論著·

RhD陰性患者輸注DEL型血液的安全性研究*

王敏 王保龍 周明 完曉菊 廖艷秋

目的 探討RhD陰性患者輸注DEL型血液的安全性。方法 采用間接抗人球蛋白法及熱吸收放散方法對(duì)RhD陰性獻(xiàn)血者血液進(jìn)行DEL型檢測(cè)，并采用DNA測(cè)序方法分析DEL型獻(xiàn)血者的RHD基因序列，回顧性分析接受DEL型血液RhD陰性患者體內(nèi)抗-D產(chǎn)生情況。結(jié)果 經(jīng)吸收放散方法確認(rèn)的13例DEL陽(yáng)性的獻(xiàn)血者均攜帶RHD1227A等位基因，12例接受DEL型血液的RhD陰性患者體內(nèi)抗-D水平均無(wú)變化，1例患者體內(nèi)抗-D水平由8升高到32。結(jié)論 DEL型血液引起抗-D同種免疫反應(yīng)的可能性較低，但DEL型血液仍具有一定的免疫原性，對(duì)于體內(nèi)已存在抗-D抗體的患者應(yīng)避免輸注DEL型血液。

DEL 抗-D RHD1227A等位基因 Rh血型

Rh血型系統(tǒng)抗原種類(lèi)較多，其中D抗原免疫原性最強(qiáng)，具有重要的臨床意義。根據(jù)D抗原的有無(wú)將Rh血型分為RhD陽(yáng)性及RhD陰性。DEL型是弱D的一種，其紅細(xì)胞膜表面D抗原表位數(shù)目較少，僅能通過(guò)敏感的吸收放散方法檢測(cè)出來(lái)，稱為D放散型。DEL型在高加索人種較少見(jiàn)，在我國(guó)RhD陰性人群中高達(dá)26%，絕大部分表現(xiàn)為RHD1227 G＞A堿基突變[1]。關(guān)于RhD陰性患者接受DEL型血液輸注的安全性一直備受臨床輸血界的關(guān)注，通過(guò)調(diào)查本院RhD陰性患者接受DEL型血液后體內(nèi)抗-D同種免疫反應(yīng)的產(chǎn)生情況，進(jìn)一步分析RhD陰性患者接受DEL型血液輸注的安全性，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 材料

1.1 標(biāo)本來(lái)源：收集本院2015年9月～2017年1月微柱玻璃珠卡式法初篩為RhD陰性的41例接受輸血的住院患者，經(jīng)間接抗球蛋白試驗(yàn)（IAT）鑒定為RhD陰性，男性8例，女性33例，年齡2月~71歲。對(duì)41例RhD陰性患者所輸注的65例獻(xiàn)血者血液通過(guò)吸收放散試驗(yàn)進(jìn)行DEL型檢測(cè)，最終確認(rèn)為DEL者17例。

1.2 試劑：血型鑒定及意外抗體篩選用微柱玻璃珠卡 （Ortho-Clinical Diagnostic）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)O型抗體篩選用紅細(xì)胞、抗體鑒定用譜細(xì)胞、多特異性抗人球蛋白抗體、標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞及抗-C、抗-c、抗-E、抗-e 血清（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；3種不同批號(hào)的IgG、IgM混合單克隆抗-D（美國(guó)IMMUCOR公司）；QIAamp DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）；RHD 1-10個(gè)外顯子引物（上海生工生物有限公司合成）；Mark 50bp DNA Ladder（美國(guó)life公司）；DNA溶解液（上海生工生物有限公司合成）；DNA染料（北京賽百盛公司）；Taq酶（上海 Promega公司）；瓊脂糖（法國(guó) Biowest公司）；DNA Isolation Kit 提取試劑盒（北京PEL-FREEZ公司）。

1.3 儀器：AutoVue Innova全自動(dòng)血型分析儀（美國(guó)強(qiáng)生）；2005-2型血型血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)（臺(tái)灣BASO）；TDZ4A-WS型水平離心機(jī)（湖南湘儀）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；DNA測(cè)序儀（美國(guó)ABI PRISM 3730全自動(dòng)測(cè)序儀）。

2 方法

2.1 吸收放散方法鑒定DEL型：將間接抗人球蛋白法檢測(cè)為RhD陰性的獻(xiàn)血者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3遍后，制成壓積紅細(xì)胞，加入等量的3種不同批號(hào)的IgG、IgM混合單克隆抗-D血清，混勻后置37℃水浴箱孵育1 h，采用大口徑試管用生理鹽水將孵育后的壓積紅細(xì)胞洗滌6遍，留取最后1次上清作為平行對(duì)照并經(jīng)IAT抗-D檢測(cè)為陰性；再加入等量的生理鹽水于壓積紅細(xì)胞中充分混勻，置56℃水浴箱中放散8~10 min，3 000 r/min，離心5 min，吸取200μl放散液并加入O型標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞2滴，混勻后37℃水浴30 min，用生理鹽水洗滌3遍后，加入100μl多特異性抗人球蛋白試劑，1 000 r/min，離心1 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.2 采用傳統(tǒng)的試管法檢測(cè)患者RhCE表型：參照文獻(xiàn)[2]。

2.3 RHD基因測(cè)序分析：參照李勤等[3]報(bào)道的方法，采用Sequencing scanner 1. 0 軟件進(jìn)行分析。2.4 抗-D效價(jià)測(cè)定：采用傳統(tǒng)的抗人球蛋白試管法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RhD陰性患者輸注DEL型血液前及輸注后1周～12個(gè)月體內(nèi)抗-D水平的變化。抽取輸注DEL型血液的RhD陰性患者外周血5 ml于枸櫞酸鈉抗凝管中，充分混勻后離心分離血清，采用微柱玻璃珠卡式法對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行意外抗體篩選，對(duì)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行意外抗體鑒定；對(duì)意外抗體鑒定為抗-D的樣本采用經(jīng)典的抗人球蛋白試管法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，倍比稀釋待測(cè)血清后，每管加入O型標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞1滴，置37℃水浴箱孵育30 min，生理鹽水洗滌3遍，再加入100μl多特異性抗人球蛋白試劑，1 000 r/min，離心1 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié)果

1 DEL表型的血清學(xué)及基因型檢測(cè) 通過(guò)間接抗人球蛋白法及吸收放散法確認(rèn)后，共有13例RhD真陰性患者輸注了DEL型血液，DEL型獻(xiàn)血者共17例，占總數(shù)的26.12%。DNA測(cè)序結(jié)果采用Sequencing scanner 1. 0 軟件分析。將得到的DNA測(cè)序結(jié)果與GenBank中的RHD基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示17例DEL型獻(xiàn)血者均攜帶RHD1227A等位基因，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2 RhD陰性患者輸注DEL型血液體內(nèi)抗-D水平的變化 經(jīng)追蹤隨訪13例輸注DEL型血液的RhD陰性患者（男性4例，女性9例），有孕產(chǎn)史的6例，4例為反復(fù)輸血。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)13例RhD陰性患者輸注DEL型血液前及輸注后1 周～6 個(gè)月期間體內(nèi)抗-D水平變化，結(jié)果顯示12例患者體內(nèi)抗-D水平無(wú)任何變化，1例患者體內(nèi)抗-D效價(jià)由8升至32，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 DEL表型RHD基因序列第9外顯子處存在堿基突變1227G→A

表1 13例RhD陰性患者輸注DEL型血液后體內(nèi)抗-D水平變化

討 論

Rh血型系統(tǒng)具有豐富的遺傳多態(tài)性，種族不同，RHD分子遺傳背景也存在一定的差異，且存在多種D變異體。D抗原變異型主要包括弱D及部分D，主要由RHD基因、重組、點(diǎn)突變、mRNA的表達(dá)降低等原因?qū)е耓4-6]。DEL型在20世紀(jì)80年代由日本學(xué)者Okubo發(fā)現(xiàn)，是一種極弱的D抗原，采用常規(guī)鑒定方法無(wú)法檢測(cè)出DEL型，只有通過(guò)敏感的吸收放散實(shí)驗(yàn)才能被檢出[7]。與高加索人種相比，DEL型在亞洲人群中呈現(xiàn)高表達(dá)，約占總RhD陰性人群的1/3，我國(guó)各地區(qū)報(bào)道的DEL型比率不同，Shao等[8]報(bào)道廣東深圳地區(qū)DEL型占初篩RhD陰性人群的26%。本課題組報(bào)道安徽地區(qū)DEL型占初篩RhD陰性人群的比率為22%[9]。采用DNA測(cè)序檢測(cè)DEL型獻(xiàn)血者RHD基因序列，結(jié)果顯示17例DEL型獻(xiàn)血者均攜帶RHD1227A等位基因。亞洲人群中DEL型個(gè)體多數(shù)攜帶完整的RHD基因，國(guó)際基因組織最先收錄的DEL型等位基因?yàn)镽HD1227A等位基因，是由單個(gè)核苷酸突變引起的，其等位基因第1 227處堿基G突變?yōu)锳[8，10-12]。 DEL型個(gè)體紅細(xì)胞D抗原位點(diǎn)數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常Rh 陽(yáng)性個(gè)體紅細(xì)胞位點(diǎn)數(shù)目。朱美玲等[13]報(bào)道DEL型紅細(xì)胞膜表面D抗原的分子數(shù)約為22個(gè)。本課題組早在2011年研究發(fā)現(xiàn)DEL型個(gè)體基本擁有完整的D抗原表位，同時(shí)DEL紅細(xì)胞膜表面D抗原強(qiáng)度極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于正常RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞，略高于真實(shí)RhD陰性紅細(xì)胞。

國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道[14，15]RhD 真實(shí)陰性受血者輸用DEL型血液后體內(nèi)抗-D 效價(jià)升高或抗-D抗體從無(wú)到有。我國(guó)學(xué)者馮雙利于2001年報(bào)道1例RhD陰性患者輸注DEL型血液后體內(nèi)產(chǎn)生抗-D抗體[16]，王寶燕等報(bào)道2例輸注DEL型血液的Rh陰性患者，抗-D 效價(jià)升高[17]。 目前我國(guó)通過(guò)間接抗人球蛋白法對(duì)RhD陰性獻(xiàn)血者進(jìn)行弱D篩查，但并未進(jìn)行DEL型檢測(cè)，臨床輸血中DEL型血液一直以此作為RhD陰性血液應(yīng)用于臨床輸血?；就暾腄抗原表位表達(dá)及攜帶完整的RHD基因表明DEL型血液仍具有一定的免疫原性，存在導(dǎo)致輸血不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

本次研究采用傳統(tǒng)的抗人球蛋白試管法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RhD陰性患者輸注DEL型血液前及輸注后1周～12個(gè)月體內(nèi)抗-D水平的變化，從而評(píng)價(jià)DEL型血液輸注給RhD真陰性患者的安全性，同時(shí)采用DNA測(cè)序檢測(cè)DEL型獻(xiàn)血者的RHD基因序列，結(jié)果顯示17例DEL型獻(xiàn)血者均攜帶RHD1227A等位基因；12例RhD陰性患者體內(nèi)抗-D水平無(wú)任何變化，效價(jià)均是0，1例RhD陰性患者體內(nèi)抗-D效價(jià)由8升至32，結(jié)果提示，DEL型血液具有一定的免疫原性。由于DEL型個(gè)體紅細(xì)胞膜表面表達(dá)的D抗原數(shù)目較少，不足以引起初次抗-D免疫應(yīng)答，因此，DEL型血液對(duì)于患者輸注前體內(nèi)未產(chǎn)生抗-D的RhD陰性患者來(lái)說(shuō)應(yīng)該是安全的，但對(duì)于患者輸注前體內(nèi)已存在抗-D抗體的患者應(yīng)避免輸注DEL型血液，因?yàn)镽hD陰性個(gè)體首次輸血或妊娠時(shí)機(jī)體會(huì)被RhD陽(yáng)性血液致敏，當(dāng)該個(gè)體再次受到D抗原刺激時(shí)，只需極少量的D抗原陽(yáng)性的紅細(xì)胞即可激發(fā)B細(xì)胞回憶反應(yīng)，導(dǎo)致大量的抗-D產(chǎn)生。對(duì)于DEL型血液輸注的安全性分析尚需擴(kuò)大樣本量，深入探討不同DEL基因型個(gè)體的免疫原性，制定出更加完善的RhD陰性患者血液輸注原則，規(guī)范RhD陰性患者血液輸注流程，確保臨床輸血安全。

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The Safety of DEL Red Blood Transfusion in RhD-negative Recipients

WANG Min，WANG Bao-Long，ZHOU Ming，et al.
Department of Blood Transfusion，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001

Objective To explore the security of DEL red blood cells transfusion to Rh negative recipient. Methods IAT and adsorption-elution were performed on the investigated blood samples to test RhD-negative recipients and DEL phenotype. RHD genotyping were performed with gene sequencing for DEL phenotypes，anti-D alloimmunization was investigated in RhD-negative recipients transfused with DEL red blood cells. Results All the DEL donors were confirmed to carry RHD RHD1227A allele. The titer and strength of anti-D antibodies of 12 true D-negative recipients who were transfused with DEL blood showed no significant difference. However，the titer of anti-D antibodies of one true D-negative recipient increased from 8 to 32.Conclusions Alloanti-D immune response induced by DEL is a rare event in true D-negative recipients. But DEL donors should be excluded for transfusion to D-negative recipients who had carried anti-D.

DEL Anti-D RHD1227A allel Rh blood group

R457.1+1 R392.13

A

1671-2587（2017）03-0230-04

201-01-05）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.006

*本課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金（No.30972815）資助

230001 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院輸血科

王敏（1982–），女，安徽宿州人，主管技師，碩士，主要從事輸血醫(yī)學(xué)工作，（E-mail）1085054623@qq.com。通信作者：王保龍，男，主任技師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事血液免疫學(xué)研究，（E-mail）wbl1965@sohu.com。