劉夢涵(中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司， 安徽 蚌埠 233010)

一種化學(xué)誘變方法對黑曲霉發(fā)酵的影響

劉夢涵(中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司， 安徽 蚌埠 233010)

經(jīng)過不同濃度的抗霉素平板對菌株進行化學(xué)誘變，通過透明圈、搖瓶篩選，獲得高產(chǎn)檸檬酸菌株。經(jīng)過穩(wěn)定性試驗，最終確定一株穩(wěn)定性好的高產(chǎn)菌株。

誘變;透明圈;產(chǎn)酸

線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生能和控制細胞凋亡的重要細胞器，被認為是細胞生存與死亡的調(diào)控中心。線粒體的膜電位及活性氧水平是衡量線粒體乃至細胞健康和損傷的關(guān)鍵活性參數(shù)之一。線粒體膜電位的崩潰或下降會導(dǎo)致腺苷三磷酸(ATP)的合成受阻，ATP酶功能逆轉(zhuǎn)，使得細胞內(nèi)ATP供應(yīng)不足，離子穩(wěn)態(tài)失衡等，最終可導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡。使用抗霉素A處理細胞時，線粒體呼吸鏈的電子傳遞受到抑制，導(dǎo)致線粒體內(nèi)活性氧的增加以及ATP能量的虧損。

抗霉素A屬于電子遞體抑制劑，具有抑制電子從細胞色素b到細胞色素C1傳遞的作用，使氧化作用不能完成，導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP合成受阻，同時會導(dǎo)致NADH不能被氧化脫氫，細胞內(nèi)NADH/NAD+水平升高。細胞內(nèi)的ATP濃度的下降，減輕了ATP對磷酸果糖激酶(PFK酶)的反饋抑制,使EMP代謝流量增加，丙酮酸和草酰乙酸生成水平提高，使檸檬酸大量積累，增加檸檬酸的生物合成(黑曲霉生長時EMP:HMP=2:1，產(chǎn)酸時EMP:HMP=4:1)。

1 萌發(fā)率試驗

表1

表2

從孢子(表1)在抗性平板上的生長現(xiàn)象可以看出，孢子生長對抗霉素A敏感。由于抗霉素A屬于電子遞體抑制劑，具有抑制電子從細胞色素b到細胞色素C1傳遞的作用，使氧化作用不能完成，導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP合成受阻，同時會導(dǎo)致NADH不能被氧化脫氫，細胞內(nèi)NADH/NAD+水平升高。在抗霉素A低濃度時可通過細胞內(nèi)底物水平磷酸化作用生產(chǎn)ATP,供細胞生長需要。

當抗霉素A濃度大于0.3mg/L后，隨著抗霉素A的濃度增加，孢子萌發(fā)率快速下降，當抗霉素A濃度為1.1mg/L時，孢子萌發(fā)率僅為1.02%。而且隨著抗霉素A濃度的增加，孢子萌發(fā)時間及產(chǎn)孢子時間都有不同程度的推遲。所以我們確定在下一步抗性篩選中，抗性平板培養(yǎng)基中的抗霉素A的濃度為0.5mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L。

2 透明圈篩選結(jié)果

根據(jù)萌發(fā)率試驗結(jié)果，我們選擇抗霉素A的濃度為0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L的PDA培養(yǎng)基的作為抗性篩選的培養(yǎng)基?？剐云桨迮囵B(yǎng)43.5h，挑選菌落形態(tài)較好、大小均勻的84個單菌落轉(zhuǎn)移清液平板，進行透明圈篩選，每個清液平板放置3個單菌落。清液平板培養(yǎng)24h，測量菌落及透明圈直徑。

根據(jù)菌落形態(tài)不發(fā)散(表2)，且H/C的值大于84個單菌落的H/C的平均值(2.92)這個標準，挑選29個單菌落轉(zhuǎn)移小斜面，進行產(chǎn)孢試驗。而這29個單菌落的H/C值在2.32～3.9之間，他們在正太分布圖中的分布頻率也較高。

3 抗性菌株搖瓶篩選

根據(jù)萌發(fā)率試驗結(jié)果，我們選擇抗霉素A的濃度為0.5mg/ L、0.7mg/L、0.9mg/L的PDA培養(yǎng)基的作為抗性篩選的培養(yǎng)基。抗性平板培養(yǎng)43.5h，挑選菌落形態(tài)較好、大小均勻的84個單菌落轉(zhuǎn)移清液平板，進行透明圈篩選，每個清液平板放置3個單菌落。清液平板培養(yǎng)24h，測量菌落及透明圈直徑。根據(jù)比值及菌落形態(tài)共挑選84個單菌落進行搖瓶篩選?？剐跃険u瓶發(fā)酵結(jié)果如(表3)，根據(jù)搖瓶篩選結(jié)果，優(yōu)選0.7A-5、0.9A-1、0.9A-3三珠菌株進行發(fā)酵性能穩(wěn)定性試驗。

表3

表4

4 抗性菌株穩(wěn)定性試驗

FC216菌種在添加抗霉素A的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過清液平板篩選、搖瓶篩選，選育出能利用玉米原料快速產(chǎn)生檸檬酸，而不利用和分解檸檬酸的菌株，菌株的產(chǎn)酸性能較出發(fā)株至少提高5%，而且菌株性能穩(wěn)定。菌株的穩(wěn)定性是衡量一株優(yōu)良菌種的重要標志，抗性菌株由于基因突變，往往失去生理特性的平衡，同時也降低了與原來環(huán)境的適應(yīng)能力，所以菌株在傳代過程，發(fā)酵產(chǎn)酸等各項性能不穩(wěn)定。所以我們計劃對抗性菌株進行穩(wěn)定性試驗?？疾炀攴€(wěn)定性一般需要對菌株進行傳代10次，然后挑選第2、4、6、8、10代分別與第一代進行搖瓶對比試驗并加以判斷。

通過對搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析，從表(四)可以看出，0.9A-1的菌株產(chǎn)酸偏差變化范圍最小，在2.0左右，變化比較平穩(wěn)。這說明該菌株隨著傳代次數(shù)的增加產(chǎn)酸性能比較穩(wěn)定。0.9A-3菌株產(chǎn)酸偏差雖然在1.0左右，變化范圍也較小，但是從第六代開始產(chǎn)酸偏差是負偏差，這說明該菌株性能開始向退化的方向進行，穩(wěn)定性差。0.7A-5菌株產(chǎn)酸偏差雖然較高，但是產(chǎn)酸偏差變化幅度相對較大，這說明該菌株隨著傳代次數(shù)的增加，穩(wěn)定性較差。