趙鶴鵬，許秋達(dá)，常 丹,周鴻立

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

香菇多糖中半乳糖醛酸的含量測定及抗氧化活性研究

趙鶴鵬，許秋達(dá)，常 丹,周鴻立*

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

研究香菇多糖中半乳糖醛酸的含量測定和抗氧化作用。采用硫酸-咔唑比色法與間羥基聯(lián)苯法測定半乳糖醛酸的含量，采用羥基自由基、總還原力、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）自由基的清除作用考察5種不同體系香菇多糖的抗氧化活性。標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸質(zhì)量濃度在26.15～78.45 μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 4，平均加樣回收率為99.87%，RSD為0.11%，最低檢出限為4.086 μg/mL，糖醛酸含量為30.25 μg/mg；香菇多糖質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)抗氧化作用大小依次為羥基自由基、總還原力、DPPH，超氧陰離子和ABTS沒在IC50范圍內(nèi)。硫酸-咔唑比色法簡便易行、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，且多糖5種體系驗(yàn)證香菇多糖具有一定的抗氧化能力。

香菇多糖；糖醛酸；咔唑-硫酸比色法；抗氧化作用

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-4-20 14:09:52

0 引言

香菇（Lentinula edodes）[1]是全球第二大人工種植的食用菌，也是我國特產(chǎn)之一，在民間素有“山珍”之稱，野生香菇主要生長在林區(qū)，種植生長在木材上。香菇味甘、性平。主治食欲減退，少氣乏力。香菇多糖（Lentinan）具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫和刺激干擾素形成等功能[2]，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Mariko等[3]用 3%三氯乙酸和 1 mol/L NaOH溶液從香菇子實(shí)體中分別提取出一種雜半乳糖和α-(1→3)-D-葡聚糖，鄒林武等[4]采用超聲法提取香菇多糖，多糖得率7.24%且有較好的抗氧化活性。多糖常以酸性雜多糖糖醛酸的形式存在，糖醛酸本身或含有糖醛酸結(jié)構(gòu)單元的低聚糖或多糖，顯示出十分重要的生物活性，糖醛酸中半乳糖醛酸的含量最多。由于中性糖、糖醛酸并不是獨(dú)立存在的，它們可能存在于同一糖鏈中，無法分離，在測定含量時(shí)可能存在相互干擾，有必要建立一種穩(wěn)定準(zhǔn)確的糖醛酸含量測定方法。常用方法有硫酸-咔唑法[5]、間羥基聯(lián)苯比色法[6-7]、離子色譜法、氣相分析和液相分析法[8]等。因色譜法對(duì)儀器要求較高且操作較為繁瑣，相比前2種方法較為常用，間羥基聯(lián)苯比色法試劑價(jià)格較高，咔唑-硫酸法測定多糖中半乳糖醛酸的含量較為常用[9-10]；采用清除羥基自由基、總還原力力、清除DPPH自由基、清除超氧陰離子自由基、清除ABTS自由基等5種方法來探究香菇多糖的體外抗氧化作用。國內(nèi)外有許多對(duì)多糖中糖醛酸研究的文章，但未見有關(guān)對(duì)香菇多糖中半乳糖醛酸的含量測定及其抗氧化作用的研究報(bào)道，本文旨在為進(jìn)一步開發(fā)香菇多糖提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；FA-2004型分析天平：上海菁海儀器有限公司；LDZ5-2型臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

鮮香菇：購自吉林省吉林市超市，經(jīng)吉林化工學(xué)院薛建飛副教授鑒定；咔唑：Aladdin；半乳糖醛酸：國藥集團(tuán)；DPPH：Sigma進(jìn)口分裝；30%雙氧水、鄰二氮菲、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵等試劑均為分析純。

1.2 香菇多糖的提取與含量測定

取洗凈的鮮香菇40 g，將其干燥后粉碎，加入800 g蒸餾水，在60℃恒溫水浴下浸提3 h后過濾，濃縮，得香菇多糖浸膏4.0 g。采用苯酚-硫酸法測得多糖的得率為11.61%，純度為10.28%。

1.3 糖醛酸的含量測定

采用上述方法提取多糖，然后進(jìn)行糖醛酸含量測定條件的考察。

1.3.1 溶液的配制

對(duì)照品溶液：精確稱取70℃干燥至恒質(zhì)量的半乳糖醛酸對(duì)照品6.537 4 mg置于50 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解定容，配成130.75 μg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精確稱取同樣條件下的香菇多糖0.100 0 g，配成2 mg/mL的多糖溶液。

硼砂-硫酸溶液：稱取0.477 g硼砂加入濃硫酸100 mL，超聲溶解，備用。

咔唑溶液：稱取咔唑0.125 0 g，溶于100 mL無水乙醇中，配成1.25%的咔唑溶液備用。

1.3.2 測定波長的選擇

分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液1 mL，緩慢加入6 mL硼砂-硫酸溶液，且放于10 mL容量瓶中，振搖混合，然后至沸水浴中煮沸5 min，以冰水冷卻至室溫，加入0.125 mg/mL咔唑溶液0.2 mL，搖勻后在沸水浴中煮沸10 min，冷卻后，以同樣處理的重蒸餾水為空白，進(jìn)行全波長掃描。

1.3.3 半乳糖醛酸最低檢測限的測定

將1.3.1配制成的對(duì)照品溶液分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，進(jìn)行全波長掃描。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精確吸取半乳糖醛酸對(duì)照品溶液2、3、4、5、6 mL于5個(gè)10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取系列濃度半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，其余同1.3.2。

1.3.5 方法學(xué)考察

對(duì)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等試驗(yàn)考察，之后測定香菇多糖中糖醛酸的含量。

1.4 抗氧化試驗(yàn)

1.4.1 清除羥基自由基能力的測定

取0.75 mmol/L鄰二氮菲1 mL于試管中，依次加入PBS（pH 7.40）2 mL，蒸餾水1 mL，充分混勻后，加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，混勻，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.12%的 H2O21 mL，37℃水浴 60 min，在536 nm處測定其吸光度Ap；用蒸餾水代替H2O2，測定其吸光度Ab；取不同濃度的香菇多糖溶液代替蒸餾水1 mL，測定吸光度As[11]。

1.4.2 還原力的測定

依次在10 mL試管中加入不同濃度的香菇多糖樣品溶液1.0 mL，磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）2.5 mL和1%鐵氰化鉀2.5 mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混勻后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和2.5 mL的蒸餾水，搖勻后在700 nm處測定吸光度，平行測定3次取平均值[12]。

1.4.3 清除DPPH自由基能力測定

取不同濃度的香菇多糖溶液2 mL，加入等體積的濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光度；空白對(duì)照組為2 mL DPPH溶液加上2 mL無水乙醇，在517 nm處測定吸光度，平行測定3次取平均值[13-14]。

1.4.4 清除超氧陰離子自由基能力的測定

取50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.20）4.5 mL,分別加入不同濃度的香菇多糖溶液1 mL，鄰苯三酚0.2 mL，混勻后立即倒入比色皿，以等體積10 mmol/L鹽酸代替鄰苯三酚溶液為空白調(diào)零，在325 nm波長下每隔30 s測定一次吸光度，對(duì)照組以等體積去離子水代替樣品溶液，平行測定3次取平均值[15-16]。

1.4.5 清除ABTS自由基能力測定

在試管中加入200 μL不同濃度的香菇多糖溶液和3 mL ABTS溶液，對(duì)照組用蒸餾水代替ABTS工作液，在室溫條件下避光放置1 h，在波長734 nm處測吸光度[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖醛酸含量測定

2.1.1 測定波長的選擇

掃描結(jié)果如圖1所示，可知對(duì)照品和供試品溶液在528 nm處有最大吸收波長，峰型為正態(tài)分布曲線，因此選528 nm為測定波長。

2.1.2 半乳糖醛酸最低檢測限的測定

掃描結(jié)果如圖1所示，將1.3.1中的對(duì)照品溶液稀釋32倍時(shí)（即質(zhì)量濃度為4.086 μg/mL）目測出最低檢測限。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在n=5時(shí)，得到線性回歸方程:y=0.013 0x+ 0.012 7，r=0.999 4。半乳糖醛酸含量在（26.15～78.45 μg/mL）之間呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照溶液在相同的操作條件下，連續(xù)操作6次，結(jié)果見表1。

圖1 半乳糖醛酸和香菇多糖的全波長掃描圖Fig.1 The full wavelength scanning of Galacturonic acid and lentinan

RSD為0.46%<1.0%，符合測定紫外分光光度計(jì)的要求，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

為使分析方法可用于常規(guī)檢驗(yàn)所規(guī)定的時(shí)間，以確保方法可行，考察穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

RSD為0.40%<1.0%，表明溶液在80 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，可進(jìn)行測定。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

用規(guī)定的方法平行測定樣本5份，結(jié)果見表3。

表1 精密度試驗(yàn)Table 1 The precision experiments

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2 The stability experiments

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 The repetitive experiments

RSD<1.0%，符合重現(xiàn)性的要求范圍。

2.1.4.4 加樣回收率試驗(yàn)

為考察其他成分對(duì)測定的干擾，按規(guī)定分析方法測定加樣回收率，結(jié)果見表4。

RSD<1.0%，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線在允許的誤差范圍內(nèi)。

表4 咔唑-硫酸法加樣回收率試驗(yàn)(n=6)Table 4 The recovery experiments

2.1.5 2種方法測定多糖中半乳糖醛酸的含量

用硫酸-咔唑法與間羥基聯(lián)苯法對(duì)香菇多糖中糖醛酸含量的測定結(jié)果如表5和表6所示。

由表5和表6可以看出，間羥基聯(lián)苯法測定的平均回收率結(jié)果比咔唑-硫酸法的RSD值大，使用硫酸-咔唑法測定的結(jié)果與理論值接近。阿里紅多糖中的糠醛酸含量，采用間羥基聯(lián)苯法測定，回收率達(dá)到93.11%[8]。本文采用咔唑-硫酸法測定回收率達(dá)到103.87%，糖醛酸含量為30.25 μg/mg。

2.2 抗氧化試驗(yàn)

香菇多糖清除羥基自由基、總還原能力、清除DPPH自由基、清除超氧陰離子自由基、清除ABTS自由基的體外抗氧化活性結(jié)果見圖2。

Vc在 5個(gè)體系的 IC50依次為 0.178、0.75、0.02、0.14、0.01。不同濃度香菇多糖對(duì)5種物質(zhì)的清除能力在一定范圍內(nèi)與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，其中羥基自由基超出本試驗(yàn)的IC50范圍，還原力IC50為0.45，DPPH自由基為0.97，超氧陰離子自由基、ABTS自由基低于IC50，說明后2個(gè)體系抗氧化作用比較弱。在活性氧自由基中，羥自由基最活躍，可快速攫取多糖碳?xì)滏溕系臍渑c羥基結(jié)合成水；多糖結(jié)構(gòu)中醇羥基可以與產(chǎn)生OH所必需的金屬離子絡(luò)合，使自由基的產(chǎn)生受到抑制，在試驗(yàn)中表現(xiàn)為抗氧化活性較強(qiáng)。

表5 咔唑-硫酸法加樣回收率試驗(yàn)(n=4)Table 5 Carbazole sulfuric acid recovery test method(n=4)

表6 間羥基聯(lián)苯法加樣回收率試驗(yàn)(n=4)Table 6 M-hydroxyldiphenyl method recovery test

圖2 香菇多糖的清除率Fig.2 The antioxidant activity of Lentinan

3 結(jié)論

本文采用水提法提取香菇多糖，以半乳糖醛酸為對(duì)照品，咔唑-硫酸比色法進(jìn)行糖醛酸含量測定，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.013 0x+0.012 7，r=0.999 4，最低檢測限濃度為4.086 μg/mL，穩(wěn)定性RSD值為0.34%，精密度RSD值為0.37%，重復(fù)性RSD值為0.29%，加樣回收率RSD值為0.11%。同時(shí)也說明中性糖對(duì)測定結(jié)果的影響較小，試驗(yàn)測得香菇多糖中的糖醛酸含量為30.25 μg/mg。表明咔唑-硫酸法能夠快速測定香菇多糖中糖醛酸的含量且準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適宜于香菇多糖中糖醛酸的含量測定。

系列抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明香菇多糖對(duì)5種體外抗氧化試驗(yàn)均有一定的作用，強(qiáng)弱順序?yàn)椋毫u基自由基>總還原力>DPPH>超氧陰離子>ABTS，前2者的抗氧化能力比Vc強(qiáng)，具有很大的利用潛能，同時(shí)為香菇多糖的基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)，但香菇多糖中糖醛酸與抗氧化作用之間的量效關(guān)系仍有待探尋。

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DETERMINATION AND ANTIOXIDATION ACTIVITY OF URONIC ACID IN POLYSACCHARIDES FROM LENTINAN

ZHAO Hepeng，XU Qiuda，CHANG Dan，ZHOU Hongli
（College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China）

Lentinan has anti-tumor，anti-virus，improving the immune function and stimulating the formation of interferon and other functions The present study was to determinate the content of lentinanuronic acid and to examine the antioxidation activity of Lentinan.The content of uronic acids was determined according to the method of Carbazolesulfuric acid colorimetry and m-hydroxydiphenyl.The antioxidant effect of Lentinan was detected by scavenging hydroxyl radical，reducing power assay，DPPH radicals，superoxide anion free radical O2-，and ABTS radical method with VCas a positive control.The results showed that a good linearity relation was existed between the absorbency and the concentration of standard galacturonic acid in the range of 26.15～78.45 μg/mL(r=0.999 4)，and the average recovery was 99.87%，RSD was 0.11%，and the lowest detection limit was 4.086 μg/mL.The content of uronic acids in Lentinan was 30.25 μg/mg.The concentration of Lentinan in the range of 0.2～1.0 mg/mL had a certain antioxidant effect，which was in the order of scavenging hydroxyl radical，reducing power assay and DPPH radicals.The superoxide anion free radical and ABTS were not within the scope of IC50.It was concluded that the method of Carbazolesulfuric acid colorimetry and m-hydroxydiphenyl to determinate the lentinanuronic acid content in Lentinan was simple，available，accurate and reproducible，and the Lentinan had been proved to have certain antioxidation effect by 5 kinds of method.

lentinan；uronic acid；carbazole-sulfuric acid colorimetry；anti-oxidation activity

TS201.2

B

1673-2383(2017)02-00100-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1409.034.html

2016-05-11

吉林省科技廳科研項(xiàng)目（20150311044YY）

趙鶴鵬（1988—），男，吉林吉林人，碩士研究生，主要從事天然有機(jī)化學(xué)的研究工作。

*通信作者