畢振原，黃繼紅，2*，劉 娜，馮軍偉，紀小國，李海月，趙 祎，張亞奇

（1.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學研究所有限公司，河南 鄭州 450000）

麥胚球蛋白的體外抗炎活性研究

畢振原1，黃繼紅1，2*，劉 娜1，馮軍偉1，紀小國1，李海月1，趙 祎1，張亞奇1

（1.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學研究所有限公司，河南 鄭州 450000）

麥胚球蛋白是一種優(yōu)質蛋白，在改善身體機能和消除炎癥方面有著重要的研究價值。通過脂多糖（LPS）干預巨噬細胞建立炎癥細胞模型，對提取麥胚球蛋白的體外抗炎活性進行了探究。通過體外細胞培養(yǎng)研究了麥胚球蛋白對RAW264.7細胞的細胞毒性；利用Griess法研究了麥胚球蛋白對RAW264.7細胞經(jīng)LPS誘導前后NO產(chǎn)生量的影響；利用ELISA法檢測實驗組對炎癥細胞模型中細胞因子TNF-α含量的影響。結果表明：麥胚球蛋白能顯著降低經(jīng)LPS誘導RAW264.7細胞因子TNF-α和NO的含量，并存在一定的劑量依賴關系。麥胚球蛋白抗炎活性的研究為功能性保健品及抗炎藥品原料開發(fā)提供了思路。

麥胚球蛋白；RAW264.7細胞；炎癥細胞模型；抗炎活性

網(wǎng)絡出版時間：2017-4-20 14:09:31

0 引言

小麥是人類歷史上最早被人工栽培的糧食作物之一，有“五谷之尊”的美譽。小麥胚芽是小麥籽粒的生命中樞，質量相當于整粒小麥的2%左右，卻蘊含著其97%的營養(yǎng)，被營養(yǎng)學家美譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”，營養(yǎng)豐富，功能全面[1]。麥胚蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，分別占26%和20%左右[2]。到目前為止，國內(nèi)外研究的重點大都是麥胚清蛋白，且研究表明其主要組成是一些蛋白酶類[3-4]；而對麥胚球蛋白的關注程度較小，尚未成為主要研究對象。

巨噬細胞源自單核細胞，是免疫效應細胞，可以對細胞殘片及病原體進行吞噬以及消化，并通過釋放細胞因子等激活免疫系統(tǒng)中的其他細胞，具有免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調節(jié)以及抗原呈遞等多種免疫功能，在機體的免疫系統(tǒng)中起重要作用[5-7]。NO是激活巨噬細胞殺滅病原微生物及腫瘤細胞的主要效應分子，能提高機體免疫力，但過量的NO也會促進炎癥發(fā)生，對組織造成損傷[8-10]。

本研究通過體外培養(yǎng)巨噬細胞觀察了麥胚球蛋白對經(jīng)脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7細胞因子（TNF-α）和一氧化氮的產(chǎn)生量，從細胞水平研究麥胚球蛋白的抗炎活性，為研究麥胚球蛋白的抗炎活性及其作用機制提供理論和實驗依據(jù)，為麥胚蛋白作為功能性保健品及抗炎藥品原料開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麥胚：河南財鑫糖業(yè)有限公司；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高糖培養(yǎng)液：美國Hyclone公司；四季青優(yōu)級胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；雙抗貯存液、Hank's溶液：杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；噻唑藍（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT）、 臺 盼 藍 ： 美 國AMERISCO 公司；脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）：美國Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；0.25%胰酶、TrypLETM Express重組酶：美國Life Technologies公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他化學試劑均為分析純。

DMEM高糖完全培養(yǎng)液：89%DMEM高糖基礎培養(yǎng)液，10%胎牛血清，1%終濃度分別為100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的雙抗貯存液。

Griess試劑的配制：稱取1 g對氨基苯磺酸，加入100 mL 5%磷酸溶液溶解；再稱取0.1 g N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽，加入100 mL 5%磷酸溶液溶解；使用前，將兩者等體積混合，即為Griess試劑。

1.2 儀器與設備

Perkin Elmer 1420酶聯(lián)免疫檢測儀：美國；SHELLAB型CO2培養(yǎng)箱；Water Jacketed Incubator：美國；OLYMPUS IMT-2型倒置顯微鏡：美國；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 麥胚提取物的制備

將麥胚進行粉碎，然后在料液比為1∶13、NaCl質量分數(shù)為3%、溫度為30℃的條件下，提取1 h，經(jīng)離心后，上清即為麥胚球蛋白提取液，冷凍干燥得到麥胚球蛋白[2]。

1.3.2 RAW264.7細胞的復蘇

從-80℃冰箱中取出RAW264.7細胞，在37℃水浴中解凍，解凍后將細胞懸液移入無菌離心管中，加入少量的DMEM完全培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min后棄上清，再加入DMEM完全培養(yǎng)液，吹打均勻后移入培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)[11-12]。

1.3.3 RAW264.7細胞懸液的制備

當RAW264.7細胞長至70%～80%的豐度（對數(shù)生長期）時，取出培養(yǎng)瓶，棄掉瓶中的培養(yǎng)基，加入10 mL PBS緩沖溶液洗滌2次，然后加入約1.5 mL 0.25%的TrypLETM Express重組酶進行消化，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使重組酶覆蓋均勻，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中消化5 min。倒置顯微鏡下觀察，當培養(yǎng)瓶中貼壁細胞大部分變?yōu)閳A狀時，即認為消化完全。此時加入10 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)液，以終止消化作用，輕輕反復吹打細胞懸液，使細胞從培養(yǎng)瓶壁脫落。然后將細胞懸液移入50 mL離心管，1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清后加入適量DMEM完全培養(yǎng)液，混勻后用臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)，調整細胞濃度至 5.0×105個/mL[5,13]。

1.3.4 麥胚球蛋白對RAW264.7細胞的毒性

取密度為5.0×105個/mL的細胞懸液，吹打均勻后接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)基，對照組每孔加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)液，樣品組分別加入等量不同質量濃度的樣品溶液（終質量濃度為0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測吸光度，根據(jù)公式（1）計算麥胚球蛋白對RAW264.7細胞的存活率[5]。

1.3.5 麥胚球蛋白對未經(jīng)LPS誘導RAW264.7細胞NO產(chǎn)生量的影響

取密度為5.0×105個/mL的RAW264.7細胞懸液，吹打均勻后以2 mL/孔的量接種于12孔培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)基，空白對照組每孔加入500 μL DMEM高糖完全培養(yǎng)液，樣品組分別加入500 μL終濃度為0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL樣品溶液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

NO標準曲線的繪制：配制濃度為0、2、5、10、15、30、40、50、60、80、100 μmol/L的 NaNO2溶液，各取100 μL并加入100 μL Griess試劑混合均勻，避光作用20 min后，在535 nm處檢測各孔的光吸收值。

細胞培養(yǎng)基中NO含量的檢測：培養(yǎng)結束后，各組每孔取培養(yǎng)基上清液 100 μL與 100 μL Griess試劑混合，避光作用20 min后，用DMEM完全培養(yǎng)液作空白對照，在535 nm處檢測其光吸收值，通過NO標準曲線計算出各孔NO的含量。

1.3.6 麥胚球蛋白對經(jīng)LPS誘導RAW264.7細胞NO產(chǎn)生量的影響

細胞種板和培養(yǎng)：取密度為5.0×105個/mL的細胞懸液，吹打均勻后以2 mL/孔的量接種于12孔培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，空白對照組每孔加入500 μL DMEM完全培養(yǎng)液，LPS對照組、地塞米松陽性對照組、樣品組分別加入500 μL 2 μg/mL的LPS溶液，培養(yǎng)0.5-1 h后，空白對照組和LPS對照組每孔加入500 μL DMEM完全培養(yǎng)液，地塞米松陽性對照組每孔加入500 μL終濃度為8 μmol/L的地塞米松溶液，樣品組分別加入500 μL終質量濃度為0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL樣品溶液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。用Griess法測定細胞培養(yǎng)基上清液中NO的含量。

1.3.7 麥胚球蛋白對經(jīng)LPS誘導RAW264.7細胞因子含量的影響

ELISA法檢測實驗組對炎癥細胞模型中細胞因子含量TNF-α的影響。細胞干預24 h后取上清液，利用相應的ELISA試劑盒按說明進行操作，測定TNF-α含量，每個試驗均設3個重復。

2 結果與分析

2.1 麥胚球蛋白對RAW264.7細胞的毒性

如圖1所示，麥胚球蛋白在100～1 600 μg/mL范圍內(nèi)對RAW264.7細胞顯示無毒性；并在100～1 600 μg/mL范圍內(nèi)對RAW264.7細胞生長具有顯著的促進作用（P<0.01）；隨著質量濃度的升高，麥胚球蛋白對RAW264.7細胞的存活率呈上升趨勢，當質量濃度為800 μg/mL時，細胞存活率達到最高值，之后出現(xiàn)下降，但是細胞存活率仍顯著高于空白組（P<0.01）。表明麥胚球蛋白對RAW264.7細胞無毒性，且對其具有顯著的增殖作用。

圖1 麥胚球蛋白對RAW264.7細胞的毒性Fig.1 The toxicity of wheat germ globulin against RAW 264.7 macrophages

2.2 不同質量濃度麥胚球蛋白對正常RAW264.7的NO產(chǎn)生量的影響

圖2為NO標準曲線，線性回歸方程為 y=0.003 1x+0.001 9，R2=0.999 7。圖3為不同質量濃度麥胚球蛋白對正常RAW264.7的NO產(chǎn)生量的影響。由圖3可知，質量濃度為100 μg/mL時對正常RAW264.7細胞NO產(chǎn)生無顯著影響（P>0.05），200～1 600 μg/mL內(nèi)具有顯著的促進作用（P< 0.01）。NO是激活的巨噬細胞殺滅病原微生物及腫瘤細胞的主要效應分子，能提高機體免疫。試驗表明，麥胚球蛋白能夠顯著促進正常RAW264.7的NO產(chǎn)生量。

2.3 不同質量濃度麥胚球蛋白對 LPS誘導RAW264.7的炎癥的抑制作用

圖2 NO標準曲線Fig.2 The standard curve of NO

圖3 不同質量濃度麥胚球蛋白對正常RAW264.7的NO產(chǎn)生量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of wheat germ globulin on NO production of RAW264.7 cells

圖4 不同質量濃度麥胚球蛋白對LPS誘導RAW264.7的NO產(chǎn)生量的影響Fig.4 Effect of different concentration of wheat germ globulin on NO production of RAW264.7 cells induced by LPS

如圖4所示，地塞米松與各質量濃度麥胚球蛋白均能顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NO的產(chǎn)生（P<0.05），但與空白組相比仍有較顯著性差異（P<0.01），麥胚球蛋白隨著質量濃度的升高抑制效應愈加顯著；當麥胚球蛋白質量濃度為100 μg/mL時，其抑制效應顯著低于地塞米松（P< 0.05）；當麥胚球蛋白質量濃度為1 600 μg/mL時，其抑制效應顯著高于地塞米松（P<0.05）；當麥胚球蛋白質量濃度在200～800 μg/mL范圍內(nèi)，其抑制效應與地塞米松無顯著性差異。綜上所述，各質量濃度麥胚球蛋白均能顯著抑制 LPS誘導的RAW264.7細胞NO的產(chǎn)生的效應，表現(xiàn)出抗炎活性，且當質量濃度為1 600 μg/mL時抗炎活性顯著高于地塞米松（P<0.05）。

2.4 不同質量濃度麥胚球蛋白對經(jīng) LPS誘導RAW264.7細胞因子（TNF-α）含量的影響

細胞受到有毒性的化學物質或病原體侵襲的時候，機體的免疫系統(tǒng)就會釋放出NF-κB。NF-κB是調控許多炎癥基因表達的關鍵轉錄因子，狀態(tài)通常是非活性，存在于細胞質中。當細胞受到TNF等刺激時，NF-κB得以活化并從細胞質移到細胞核，啟動多種炎癥基因表達，使大量的炎癥細胞處于發(fā)生炎癥的部位周圍[15]。NF-κB發(fā)生核轉位是一些免疫和炎癥反應的重要步驟，應用NF-κB抑制劑來減少炎癥介質的產(chǎn)生成為治療炎癥的新思路。TNF-α在炎癥細胞因子產(chǎn)生的級聯(lián)效應中屬于末期的分子，同時也是炎癥中起正反饋調控的關鍵分子，參與多種局部和全身的炎癥反應[15-16]。

從圖5可以看出，LPS誘導后細胞因子TNF-α的含量與空白對照組比較有極顯著的升高（P< 0.01），說明造模成功。而地塞米松與麥胚球蛋白干預組中的TNF-α的含量均顯著低于LPS組。其中，當麥胚球蛋白質量濃度為100 μg/mL時，TNF-α的含量顯著高于地塞米松組（P＜0.05）；當麥胚球蛋白質量濃度為1 600 μg/mL時，TNF-α的含量顯著低于地塞米松組（P＜0.05）。這表明麥胚球蛋白干預后細胞所分泌的炎癥介質TNF-α的含量有顯著降低，且成一定的劑量依賴關系，表明麥胚球蛋白對促炎因子有明顯的抑制作用。

圖5 不同質量濃度麥胚球蛋白對LPS誘導RAW264.7的TNF-α產(chǎn)生量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of wheat germ globulin on TNF-α production of RAW264.7 cells induced by LPS

3 結論

TNF-α能促使中性粒細胞聚集、內(nèi)皮細胞黏附分子上調、凝血酶原效應等，在炎性反應、免疫應答的啟動和持續(xù)過程中具有不可或缺的作用，是炎癥反應的核心環(huán)節(jié)，血清 TNF-α的水平可反映炎癥的嚴重程度[16-17]。試驗假設麥胚球蛋白具有抗炎作用，以LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應及抗炎機制普遍模型為研究載體，以TNF-α作為抗炎療效指標，采用直接干預模式探討了麥胚球蛋白的抗炎作用。

炎癥反應Toll信號傳導通路顯示，LPS進入細胞主要通過脂多糖結合蛋白 CD14受體和Toll樣受體4等信號轉導途徑，從而引起系列的炎癥反應[5,15-16]。RAW264.7細胞受到脂多糖 (LPS)等外界刺激后能夠啟動體內(nèi)炎癥介質產(chǎn)生并啟動機體抵抗炎癥系統(tǒng)的功能，激活轉錄因子細胞核因子NF-κB和活化相關蛋白，引起各種細胞因子和炎癥介質的過度表達，引起機體內(nèi)的炎癥多米諾骨牌反應，進一步引起全身炎癥反應綜合征。一氧化氮 (NO)作為介導炎癥反應的關鍵因子，在外界刺激致機體損傷中起重要作用。一氧化氮在炎癥初期，起保護作用，但是過多的 NO可以促進巨噬細胞釋放 IL-1、TNF-α等促炎因子，這些促炎性細胞因子可以刺激巨噬細胞分泌產(chǎn)生更多的 NO，形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應，因此能抑制NO分泌產(chǎn)生的物質具有抗炎的作用。

實驗研究顯示麥胚球蛋白有顯著的抗炎作用，各質量濃度麥胚球蛋白對RAW264.7細胞無毒性，能夠顯著促進正常RAW264.7的NO產(chǎn)生量；各質量濃度麥胚球蛋白均能顯著抑制 LPS誘導的RAW264.7細胞NO的產(chǎn)生，且隨著質量濃度的升高抑制效應愈加顯著；對促炎因子TNF-α有明顯的抑制作用，說明麥胚球蛋白在與促炎因子相關的炎癥疾病中起到一定的抗擊炎癥的作用。

雖然試驗證實了麥胚球蛋白的良好的抗炎效果，但麥胚球蛋白的抗炎機制及其構效關系還需要做以下工作：（1）麥胚球蛋白的抗炎活性的大小與其分子質量、氨基酸組成、首末段氨基酸、二級結構等關系密切，需要應用高度專一性的分離手段如親和層析技術、分子印跡技術分離具有高抗炎活性的麥胚球蛋白單體。（2）大量人源化細胞的抗炎效果和對促炎因子的作用需要進一步的深入研究。體外細胞實驗和動物實驗相結合驗證麥胚球蛋白的抗炎效果及對應的劑量關系是未來研究的重點。（3）麥胚球蛋白抗炎過程中，細胞通路的研究如在Toll信號傳導通路中的具體的作用位點和機制需要從理論上和實驗上做進一步的驗證?？傊?，麥胚球蛋白的抗炎作用的研究可以有效地提高麥胚資源的綜合利用，同時也為功能性保健品及藥品原料的開發(fā)提供了借鑒。

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Abstract：Wheat germ globulin is a kind of high quality protein，which has important research value on improving somatic function and eliminating inflammation.Lipopolysaccharide（LPS）intervening macrophage inflammatory cell model was established，and the anti-inflammatory activity of extracted wheat germ globulin was studied in vitro.The cytotoxicity of wheat germ globulin on RAW264.7 cells was examined through cell culturation in vitro.The influence of wheat germ globulin on the NO production before and after RAW264.7 cells induced by LPS were studied by Griess method，while the content of cytokines TNF-α in inflammatory cell model was detected by ELISA method.The results showed wheat germ globulin had significant anti-inflammatory ability，and was non-toxic on RAW264.7 cells；wheat germ globulin could significantly promote the NO production of normal RAW264.7；the different concentrations of wheat germ globulin could significantly inhibit the NO production of RAW264.7 cell induced LPS，and the inhibitory effect was increased in dose manner; wheat germ globulin also had significantly inhibition effect on proinflammatory factor TNF-α.It was concluded thatwheatgerm globulin had anti-inflammation effecton theassociated diseasesofpro-inflammatory inflammatory.The present study will provide supplyment for the development of the functional health food and raw materials of anti-inflammatory drugs.

THE ANTI-INFLAMMATORY FUNCTION OF WHEAT GERM GLOBULIN IN VITRO

BI Zhenyuan1，HUANG Jihong1，2，LIU Na1，F(xiàn)ENG Junwei1，JI Xiaoguo1，LI Haiyue1，ZHAO Yi1，ZHANG Yaqi1
（1.School of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Food Industry Research Institute of Henan Province，Zhengzhou 450000，China；）

wheat germ globulin；RAW264.7 cell；macrophage inflammatory cell model；anti-Inflammatory

Q26

B

1673-2383(2017)02-0063-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1409.022.html

2016-08-24

河南工業(yè)大學谷物資源轉化與利用省級重點實驗室開放課題（001254）；河南省國際科技合作與交流項目（152102410032）；鄭州市國際科技合作與交流項目（141PGJHZ546）

畢振原（1990—），男，河南商丘人，碩士研究生，研究方向為微生物與生化藥學。

*通信作者