于紅果，陳復(fù)生，楊宏順，賴少娟，張麗芬

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.蘇州工業(yè)園區(qū)新國大研究院，江蘇 蘇州 215123；3.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

櫻桃果膠降解機(jī)理的研究

于紅果1，陳復(fù)生1，楊宏順2*，賴少娟3，張麗芬1

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.蘇州工業(yè)園區(qū)新國大研究院，江蘇 蘇州 215123；3.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

研究了櫻桃采后貯藏過程中果膠納米結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，同時(shí)通過果膠酶與櫻桃果膠的體外反應(yīng)來模擬果實(shí)內(nèi)部果膠的降解過程。研究表明：隨著櫻桃在采后貯藏時(shí)間的延長，果膠的聚集體逐漸減少，單分子的線性結(jié)構(gòu)增多，櫻桃果實(shí)中鏈寬值小于30 nm的水溶性果膠（WSP）分子鏈在貯藏初期（0 d）、中期（14 d）和末期（28 d）出現(xiàn)頻率分別為12.50%、17.40%和33.33%；鏈寬值小于30 nm的分子鏈在1∶500（果膠酶∶WSP）、1∶50和1∶5果膠酶處理組出現(xiàn)頻率分別為10.52%、25.00%和42.85%，果膠酶對(duì)果膠的作用結(jié)果與貯藏時(shí)間對(duì)果膠的影響結(jié)果類似，堿性果膠（SSP）的降解過程與WSP類似。結(jié)果表明，果膠多糖在果蔬貯藏期間的變化是由果膠酶作用與果膠多糖組分引起，果膠的鏈寬值是由一些基本單元組成（11.7 nm、15.7 nm、19.5 nm和23.2 nm），果膠分子中的其他鏈寬值可以由這些基本單元經(jīng)過加和得到。

櫻桃；果膠；原子力顯微鏡；果膠酶；降解

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-4-20 14:08:55

0 引言

櫻桃色澤鮮艷、美味可口、營養(yǎng)豐富，但由于櫻桃果實(shí)在采后極易軟化、不耐儲(chǔ)運(yùn)、供應(yīng)期短，嚴(yán)重影響了其經(jīng)濟(jì)效益[1]，因而探明櫻桃果實(shí)軟化的本質(zhì)原因顯得尤為重要。果膠是與果蔬質(zhì)地密切相關(guān)的一種復(fù)雜多糖[2]，而質(zhì)地與果蔬的新鮮度和品質(zhì)密切相關(guān)，因此果膠是果蔬重要的品質(zhì)屬性之一，對(duì)于果蔬的可接受程度非常重要[3]。果實(shí)細(xì)胞壁多糖之間通過交聯(lián)來維持細(xì)胞壁復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，水果質(zhì)地的不同是由交聯(lián)降解的方式不同造成的。研究表明，果蔬在采后貯藏期間質(zhì)地的變化與細(xì)胞壁多糖的溶解度和解聚密切相關(guān)，是由多種細(xì)胞壁降解酶促使細(xì)胞壁多糖發(fā)生降解而引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致[4]。目前這些結(jié)論已經(jīng)在番茄、草莓和桃子等果蔬中得到了驗(yàn)證[5-7]。對(duì)于引起細(xì)胞壁多糖降解的細(xì)胞壁降解酶研究多集中在其酶活性的變化上，關(guān)于細(xì)胞壁降解酶對(duì)細(xì)胞壁多糖物質(zhì)的具體影響的報(bào)道較少。本研究利用果膠酶對(duì)果膠物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，模擬果實(shí)在采后貯藏期間果膠的變化情況，并通過原子力顯微鏡對(duì)果膠微觀結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行觀測(cè)分析，這非常有助于研究并闡明貯藏過程中果實(shí)質(zhì)地變化的根本原因。

本文以拉賓斯大櫻桃為對(duì)象，利用果膠酶對(duì)所得到的櫻桃果膠進(jìn)行反應(yīng)，模擬自然貯藏過程中果實(shí)體內(nèi)果膠酶對(duì)果膠的作用，并將兩個(gè)過程進(jìn)行比較分析，這有助于研究果膠酶對(duì)采后果實(shí)中果膠多糖的作用，闡明果膠多糖的降解機(jī)理，為研究櫻桃質(zhì)地軟化的本質(zhì)原因提供理論支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 原料與主要試劑

櫻桃（拉賓斯）：采摘于河南省鄭州市櫻桃溝；無水乙醇（AR）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；DMSO（AR）、硫酸（GR）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；氯仿（AR）：洛陽市化學(xué)儀器廠；咔唑（CR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)D-半乳糖醛酸（叟97.0%）：美國Fluka公司；果膠酶：美國 Sigma公司；AFM探針：美國Vecco公司；云母片：上海愛建納米技術(shù)公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀（TA-XT 2i）：英國 Stable Micro Systems公司；GL-20C高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；Tu-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；移液槍：德國ETTDORF公司；ZLAFM-Ⅱ型原子力顯微鏡：上海卓倫微納米設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料的處理

大櫻桃（拉賓斯），采摘時(shí)選擇約八成熟的果實(shí)，要帶果柄，采收后及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選色澤大小一致且表面無創(chuàng)傷的果實(shí)，一部分用于果實(shí)理化指標(biāo)的測(cè)定及果膠多糖的提取，其余在4℃冰箱中冷藏，每7 d取果實(shí)進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定及多糖的提取，28 d后結(jié)束貯藏。

1.3.2 櫻桃果膠的提取

果膠多糖的提取過程依照Chen等[3，8]的方法進(jìn)行，得到水溶性果膠（WSP）和堿性果膠（SSP）。

1.3.3 體外模擬果膠酶對(duì)果膠多糖的降解作用

稱取一定量由新鮮櫻桃果實(shí)提取的WSP和SSP，分別溶解于pH為5的磷酸鹽緩沖液中，將溶解后的果膠分為4等份，用等體積不同濃度的果膠酶與果膠溶液在5℃準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速在沸水中進(jìn)行滅酶處理5 min，滅酶結(jié)束后用冰水快速冷卻，所得酶解液經(jīng)冷凍干燥后用于原子力顯微鏡試驗(yàn)分析。

1.3.4 櫻桃果膠多糖的原子力顯微鏡試驗(yàn)及圖像分析

將1.3.3和1.3.4中得到的WSP和SSP經(jīng)過冷凍干燥后分別用去離子水稀釋至約10 μg/mL，將所得稀釋液充分振蕩，并在70℃水浴中保溫5 min后高速振蕩約30 s，使果膠充分分散展開。取約10 μL經(jīng)充分振蕩的稀釋液滴在新剝的云母片上，自然干燥，利用原子力顯微鏡中的非接觸模式進(jìn)行成像掃描，每個(gè)樣品掃描多張圖像[9]。

果膠聚集體和單分子結(jié)構(gòu)的鏈寬和鏈高可以采用原子力顯微鏡配套軟件進(jìn)行離線分析，所得到的圖像中亮和暗的部分表示果膠中的高和低的部分，所有的圖像采用高差模式。

對(duì)所得圖像的定性分析可以直接從圖像上看到，定量分析則需要在離線模式下運(yùn)用剖面線插件進(jìn)行測(cè)定，如圖1所示，將光標(biāo)分別置于峰高度的1/2處，單個(gè)分子的寬度（W）可以使用兩個(gè)光標(biāo)的間距即半峰寬表示；分子的高度（V）可以用峰底部和基部的高度差表示，每個(gè)鏈寬值出現(xiàn)的次數(shù)及百分比記為頻率，每組樣品利用多個(gè)平行樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

圖1 AFM剖面線分析界面Fig.1 AFM hatching analysis interface

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件和Origin 8.5進(jìn)行計(jì)算、分析和繪圖，所有指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)多次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 櫻桃果實(shí)WSP降解機(jī)理的研究

2.1.1 貯藏期間櫻桃果實(shí)WSP微觀結(jié)構(gòu)變化規(guī)律

貯藏期間櫻桃果實(shí)WSP的AFM圖像如圖2所示。由圖2可以看出，櫻桃果實(shí)中果膠多糖在冷藏初期（0 d）主要以分子聚集體和交聯(lián)的線性分子形式存在，隨著貯藏時(shí)間的延長，果膠逐漸發(fā)生降解，在貯藏末期（28 d）果膠聚集體明顯減少，線性單分子結(jié)構(gòu)明顯增多。

通過原子力顯微鏡中的剖面線插件分析不同貯藏期的WSP分子的鏈寬值、鏈高值及頻率，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，果膠分子的鏈寬值有一定的規(guī)律性，其鏈寬值由11.7 nm、15.7 nm和19.5 nm 3個(gè)基本單元組成。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，在貯藏初期，鏈寬值集中在50～80 nm，出現(xiàn)頻率為54.21%，而相同鏈寬范圍的鏈在貯藏中期和貯藏末期出現(xiàn)頻率為30.45%和18.50%；鏈寬值小于30 nm的分子鏈在貯藏初期、中期、末期出現(xiàn)頻率分別為12.50%、17.40%和33.33%，而櫻桃果實(shí)WSP的鏈高值并沒有發(fā)生顯著變化，主要集中在1～3 nm之間。表明隨著貯藏時(shí)間的延長，果膠可能主要是在鏈寬方向上發(fā)生降解，大的鏈寬值的果膠鏈不斷發(fā)生降解，使大鏈寬值的分子鏈出現(xiàn)頻率不斷減少，降解為小鏈寬值的分子鏈，最終降解為基本單元。

圖2 貯藏過程中櫻桃WSP微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.2 Nanostructural changes of WSP in cherry during storage

表1 櫻桃貯藏期間WSP鏈寬值及分布頻率Table 1 Height（V）and frequency（Fq）of particular chain width（W）of WSP chains in cherry during storage

2.1.2 果膠酶對(duì)櫻桃WSP微觀結(jié)構(gòu)影響規(guī)律的研究

不同濃度果膠酶處理對(duì)WSP形態(tài)、鏈寬值及頻率分布的影響如圖3和表2所示。

由圖3和表2可以看出，不同濃度果膠酶對(duì)櫻桃WSP鏈的酶解結(jié)果與貯藏時(shí)間對(duì)WSP鏈的作用結(jié)果類似，在這兩種不同處理過程中WSP有很多共同點(diǎn)。WSP鏈寬值受果膠酶處理的影響很大，隨著果膠酶濃度的增大，果膠大的聚集體逐漸消失，果膠鏈之間的交聯(lián)程度逐漸降低。對(duì)于不同的酶解處理組，1∶5（果膠酶∶WSP）處理組比1∶500處理組有更多的小鏈寬值的分子鏈，0、1∶500、1∶50、 1∶5處理組中鏈寬值大于60 nm的分子鏈出現(xiàn)頻率分別為29.19%、26.30%、15.00%和4.76%，鏈寬值小于 30 nm的鏈所占比例分別為 12.51%、10.52%、25.00%和42.85%，隨著果膠酶濃度的增大，果膠多糖逐漸被酶解成單糖結(jié)構(gòu)，大鏈寬值的鏈不斷減少，小鏈寬值的鏈不斷增多。酶解過程中櫻桃果膠分子鏈寬值與貯藏過程中一樣具有規(guī)律性，由3個(gè)基本單元組成。

2.2 櫻桃果實(shí)SSP降解機(jī)理的研究

2.2.1 貯藏期間櫻桃果實(shí)SSP微觀結(jié)構(gòu)變化規(guī)律

櫻桃果實(shí)在不同貯藏期間的SSP的典型AFM圖像如圖4所示。

圖3 不同酶解程度的WSP的微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Nanostructural changes of WSP in cherry with different pectinase treatments

表2 不同酶解程度的WSP鏈寬值及頻率分布Table 2 Height（V）and frequency（Fq）of particular chain width（W）of WSP chains in cherry with significant pectinase treatments

圖4 貯藏過程中櫻桃果實(shí)中SSP的典型AFM圖像Fig.4 Typical AFM images of SSP in cherry during storage

由圖4可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，SSP分子聚集體逐漸減少，小的聚集體和線性單分子逐漸從中釋放分離，在貯藏末期，果實(shí)中SSP發(fā)生明顯降解。

不同貯藏期的櫻桃SSP的鏈寬值、鏈高值及分布頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，鏈寬值大于100 nm的果膠鏈在貯藏初期、中期和末期分布頻率分別為28.00%、14.82%和4.17%，鏈寬值小于30 nm的分子鏈在貯藏初期、中期和末期分布頻率分別為29.00%、25.93%和45.84%，即隨著貯藏時(shí)間的延長，大鏈寬值的果膠鏈不斷降解為小鏈寬值的分子，造成小鏈寬值的果膠鏈所占比例不斷增加。

表3 櫻桃貯藏期間SSP鏈寬及分布頻率Table 3 Height（V）and frequency（Fq）of particular chain width（W）of SSP in cherry during storage

2.2.2 果膠酶對(duì)SSP納米結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律研究

不同濃度果膠酶處理的SSP微觀結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化如圖5所示。

果膠酶對(duì)SSP分子的影響與WSP相似，隨著酶解程度的增大，分子聚集體逐漸減少，小的聚集體和線性分子逐漸從大的分子聚集體上分離。

表4顯示了不同果膠酶處理對(duì)SSP鏈寬值及頻率分布的影響規(guī)律，從定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，SSP分子鏈寬值的基本構(gòu)成單元沒有變化，對(duì)于不同酶解程度，0、1∶500（果膠酶∶SSP）、1∶50、1∶5中鏈寬值大于100 nm的分子鏈出現(xiàn)頻率分別為28.00%、25.92%、16.67%和4.00%，鏈寬值小于30 nm的鏈所占比例分別為8.00%、7.41%、20.83%和32.00%，隨著果膠酶濃度的增大，大鏈寬值的果膠鏈出現(xiàn)頻率減少，小鏈寬值的果膠鏈出現(xiàn)頻率增大，這與貯藏時(shí)間對(duì)SSP的影響結(jié)果相似。本試驗(yàn)所得結(jié)論與前期研究結(jié)果相符合[9-11]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用原子力顯微鏡研究了櫻桃果膠在采后貯藏過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，貯藏初期櫻桃果實(shí)果膠主要以大分子聚集體和交聯(lián)緊密的線性分子形式存在，隨著貯藏時(shí)間的延長，大聚集體逐漸減少消失，單分子的線性結(jié)構(gòu)數(shù)量增多；經(jīng)過定量分析發(fā)現(xiàn)，在貯藏過程中果膠鏈逐漸被降解，大鏈寬值的分子鏈出現(xiàn)頻率逐漸減少，小鏈寬值的分子鏈出現(xiàn)頻率變大。

通過對(duì)不同酶解程度的櫻桃果膠納米結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，果膠酶對(duì)果膠的酶解作用結(jié)果與貯藏時(shí)間對(duì)果膠的作用結(jié)果相似。隨著酶解程度的增大，果膠的聚集體結(jié)構(gòu)消失，表明在貯藏期間果實(shí)中果膠多糖形態(tài)及尺寸的變化是由果膠酶和果膠多糖之間的反應(yīng)引起的。

通過定量分析果膠多糖的鏈寬值發(fā)現(xiàn)，櫻桃果實(shí)中WSP、SSP的鏈寬值是由一些基本單元（11.7 nm、15.7 nm、19.5 nm和23.2 nm）經(jīng)過平行交聯(lián)鏈接形成不同尺寸的果膠分子，貯藏過程中，大鏈寬值的櫻桃果膠鏈不斷發(fā)生降解，使大鏈寬值的分子鏈出現(xiàn)頻率不斷降低，降解為小鏈寬值的分子鏈，最終降解為基本單元，果膠分子交聯(lián)方式的不同使果蔬的質(zhì)地產(chǎn)生差異性。

圖5 不同酶解程度SSP的典型AFM圖像Fig.5 Typical AFM images of SSP in cherry with different pectinase treatments

表4 不同酶解程度的SSP鏈寬值及頻率分布Table 4 Height（V）and frequency（Fq）of particular chain width（W）of SSP in cherry with significant pectinase treatments

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RESEARCH ON THE DEGRADATION MECHANISM OF CHERRY PECTIN

YU Hongguo1，CHEN Fusheng1，YANG Hongshun2，LAI Shaojuan3，ZHANG Lifen1
（1.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.National University of Singapore（Suzhou）Research Institute，Suzhou 215123，China；3.School of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

The research investigated the changes of physical characteristics and pectin nano structure in cherry during post-harvest storage，and also simulated the pectin degradation process of cherry in the natural storage through the reaction of pectinase and pectin.The results showed that the pectin aggregate in cherry decreased，mono-molecule linear structure increased with the storage time;water-soluble pectin（WSP）chains with chain width less than 30 nm in cherry fruits occurred with frequency of 12.5%，17.4%and 33.33%during storage for 0 day，14 days and 28 days;molecular chains with width less than 30 nm occurred with frequency of 10.52%，25.00%and 42.85%in three pectinase treatment groups（pectinase∶WSP=1∶500，1∶50 and 1∶5）；the results of pectinase treatment were similar to that of storage time;and the degradation process of SSP was similar to WSP. The results indicated that changes of pectin polysaccharide during storage was due to the reaction between pectinase and pectin polysaccharide;the width of pectin chain was composed of basic units（11.7 nm，15.7 nm，19.5 nm，23.2 nm）；and other chain width values could be obtained from these basic units.

cherry；pectin；AFM（atomic force microscope）；pectinase；degradation

TS201.2

B

1673-2383(2017)02-0001-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1408.002.html

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371851、31071617、31200801)；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20141220）

于紅果（1990—），女，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚Y源開發(fā)與利用。

*通信作者