劉雪蓮 王 旭 李 薇

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

血漿/血清游離MicroRNAs在肺癌檢測中的研究進展

劉雪蓮 王 旭 李 薇

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

microRNA；肺癌

安全有效的臨床檢測手段對于惡性腫瘤患者的早期篩查、精確診斷以及在治療過程中的病情監(jiān)測至關(guān)重要。傳統(tǒng)組織病理活檢雖然為惡性腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其有創(chuàng)性往往難以在腫瘤患者治療過程中進行多時間點采樣來監(jiān)測病情變化。各種無創(chuàng)的影像學(xué)檢查則由于存在準(zhǔn)確性低、表現(xiàn)滯后等缺陷不能作為惡性腫瘤臨床上的獨立檢測手段〔1〕。近年來，液體標(biāo)本活檢技術(shù)在惡性腫瘤檢測中的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，本文主要概述了目前血漿、血清游離MicroRNAs(miRNAs)在肺癌檢測中的研究進展。

1 miRNAs

miRNAs是一類短鏈、非編碼RNA家族。早在1993年Lee等〔2〕就在線蟲發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了時序調(diào)節(jié)微小RNA(stRNA)let-7和它的靶基因lin-41，這種微小RNA具有高度保守性及序列特異性。隨著研究的深入，研究者們先后在線蟲、果蠅、鼠類、人等生物中發(fā)現(xiàn)了許多這種具有高度保守性、調(diào)控時序性以及序列特異性的小片段、非編碼RNA，并將這類RNA統(tǒng)一命名為microRNAs〔3～6〕。與傳統(tǒng)的RNA干擾(RNAi)所形成雙鏈RNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制不同，miRNAs可通過識別靶mRNA 3'UTR的互補序列降解靶mRNA或在翻譯水平對靶mRNA進行負(fù)調(diào)控從而影響基因的表達〔7〕。研究表明miRNAs也可與靶mRNA 5'UTR及開放閱讀框架的互補序列結(jié)合而發(fā)揮其功能〔8〕。

2 血漿/血清miRNA來源

關(guān)于外周血中miRNAs的來源問題目前存在如下3種假說。(1)無需能量的被動釋放，這種來源方式可以發(fā)生于病理條件下的組織破壞和細(xì)胞凋亡。尤其是在惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移以及慢性炎癥的前提下，正常的組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致miRNAs的釋放。值得注意的是，健康人外周血中的miRNAs往往來源于血小板、單核細(xì)胞等特定的血細(xì)胞，可能是由于這類血細(xì)胞壽命較短的緣故，但此種來源并不是循環(huán)中miRNAs來源的主要方式。(2)依賴于能量以及溫度的主動釋放，這種方式類似于荷爾蒙以及細(xì)胞因子的釋放過程，健康人生理狀態(tài)及腫瘤、炎癥等病理刺激下均有來源于該種途徑的miRNAs。(3)miRNAs以細(xì)胞衍生的微泡形式被釋放，這種微泡包括胞外體、微粒兩種形式。胞外體約為50～90 nm大小，起源于細(xì)胞內(nèi)吞作用，在多囊脂質(zhì)體與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合后被釋放。微粒的直徑一般大于100 nm，由細(xì)胞質(zhì)膜的一部分組成。以這兩種方式存在的miRNAs可發(fā)揮不同的生物功能，例如微粒對補體級聯(lián)反應(yīng)以及磷脂酶A2的激活具有重要作用〔9〕。而胞外體的生物功能更為廣泛，近年來其在通路蛋白的分泌〔10〕、免疫調(diào)節(jié)〔11〕、抗原呈遞〔12〕等中的作用被逐一證實。

3 血漿/血清中miRNA的存在方式及穩(wěn)定性

外周血中除少部分被動釋放的無囊泡游離miRNAs之外，大多miRNAs以微泡(胞外體、微粒)、凋亡小體及蛋白復(fù)合體等特定形式穩(wěn)定存在〔9〕。2008年Chen等〔13〕、Mitchell等〔14〕先后證實了血清/血漿中miRNAs的穩(wěn)定存在。隨后的許多研究證實了外周血miRNAs不僅在室溫條件下存在，甚至可以在強酸(pH=1)、強堿(pH=13)、反復(fù)凍融、100℃煮沸20 min等極端條件下穩(wěn)定存在〔13～18〕。然而關(guān)于血清/血漿中miRNAs為何能夠逃脫核糖核酸酶消化而穩(wěn)定存在的機制仍尚不明確，目前主要有如下兩種觀點：(1)外周血中miRNAs以微泡形式(包括胞外體、微粒)存在，這種結(jié)構(gòu)可以有效保護外周血中的miRNAs。(2)外周血中穩(wěn)定存在的miRNAs主要以蛋白復(fù)合體的形式存在，這些RNA結(jié)合蛋白包括Ago2、NPM1以及脂蛋白復(fù)合物(如高密度脂蛋白HDL)等。Arroyo等〔19〕證明了結(jié)合有Ago2蛋白的miRNAs復(fù)合體在血漿中具有更好的穩(wěn)定性。Turchinovich等〔20〕驗證了上述觀點并證實了其余Ago1、3、4等RNA結(jié)合蛋白與血漿中miRNAs的結(jié)合。隨后的研究中Wang等〔21,22〕分別發(fā)現(xiàn)了NPM1以及HDL2種miRNAs結(jié)合蛋白。但目前關(guān)于血漿/血清中miRNAs的各種功能機制研究仍較少，關(guān)于miRNAs進入血液循環(huán)、運輸以及進入靶細(xì)胞的方式仍不清楚，這一系列問題有待進一步的研究。

4 血漿/血清miRNAs在肺癌檢測中的應(yīng)用

早在2008年Lawrie等〔23〕分別測定了60例DLBCL患者與43名健康對照者血清中miR-155、210、21的水平，并發(fā)現(xiàn)DLBCL患者血清中上述3種miRNAs水平明顯高于健康對照人群，首次發(fā)現(xiàn)了血清miRNAs作為無創(chuàng)、腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物在惡性腫瘤診斷中的潛在應(yīng)用價值。同年，Taylor等〔16〕首次通過測序方法發(fā)現(xiàn)了miR-25,223在 NSCLC患者血清中的異常高表達，由此開創(chuàng)了惡性腫瘤患者外周血miRNAs檢測的新時代。本文將目前在肺癌診斷、治療及預(yù)后中研究較多的miRNAs分別歸納在表1，表2中。

表1 循環(huán)游離miRNAs與肺癌的診斷

表2 循環(huán)游離miRNAs與肺癌的治療及預(yù)后

4.1 血漿/血清miRNAs與肺癌診斷

4.1.1 血漿/血清miRNAs與高危人群的早期篩查 眾所周知LDCT是目前肺癌常用的篩查手段之一，但由于其存在一定的假陽性率，且LDCT檢查費用較高，故其臨床應(yīng)用相對受限。 Sozzi等〔1〕的研究證實應(yīng)用血清miRNAs診斷肺癌的敏感及特異性與LDCT相當(dāng)，分別為87%,81%和 88%,80%。但對于鑒別致死性肺部疾患，血清miRNAs檢測的敏感及特異性則高達99%和99.86%，對比LDCT的79%和81%有顯著差異。而單獨應(yīng)用LDCT篩查肺癌具有19.4%的假陽性率，若聯(lián)合應(yīng)用血清miRNAs及LDCT手段進行肺癌篩查，其假陽性率可減少5倍以上。隨后Montani等〔48〕在1 115例的大樣本研究中驗證了這一結(jié)論，所測得血清miRNAs篩查肺癌的精準(zhǔn)度、靈敏度、特異性分別為74.9%，77.8%，74.8%，由此提出可通過測定肺癌高危人群血清中的miRNAs來篩選最適合早期行LDCT篩查的人群。此外，2011年Boeri等〔24〕發(fā)現(xiàn)與健康對照人群相比，NSCLC患者血漿中miR-7,21,200b,210,219-1,324等的表達水平異常增高，而miR-126,451,30a,486等的表達水平降低。Shen等〔31〕在對比了肺部良惡性結(jié)節(jié)患者血漿中3種miRNAs的表達水平后發(fā)現(xiàn)，肺癌患者中miR-21,210表達水平顯著增高，而血漿中miR-486-5p水平則低于肺部良性結(jié)節(jié)人群。隨后Hennessey等〔34〕發(fā)現(xiàn)血清miR-15b,27b水平在健康對照與NSCLC人群中存在表達差異。由此研究者們認(rèn)為這些循環(huán)中異常表達的miRNAs可作為篩查肺癌的重要生物標(biāo)志物。近年來關(guān)于血清/血漿miRNAs作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌檢測的研究逐漸增多，此類研究大多集中于NSCLC與健康人群外周血中miRNAs表達差異的比較，目前發(fā)現(xiàn)miR-let7,miR-17-92cluster,miR-155,miR-21,miR-145,miR-486-5p,miR-126,miR-486,miR-205,miR-328等〔49〕在肺癌患者外周血中的表達與健康對照人群存在顯著差異。然而，盡管外周血miRNAs作為肺癌的生物標(biāo)志物用于早期篩查及診斷疾病的意義比較明晰，但與肺癌相關(guān)的miRNAs種類繁多、作用機制復(fù)雜，未來有待更多大樣本研究來篩選和挖掘更多人類肺癌相關(guān)的miRNAs，進一步完善人類肺癌miRNAs譜。

4.1.2 血漿/血清miRNAs與惡性腫瘤的分期、分型 2011年Silva等〔30〕應(yīng)用基因芯片方法對比了28例NSCLC患者與20名健康人群血漿中365種miRNAs的表達差異情況，并應(yīng)用qRT-PCR方法在另外一組人群中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)血漿中miR-let-7f,miR-20b,miR-30e-3p,miR-223 以及miR-301等5種miRNAs水平與NSCLC患者病理分型以及分期關(guān)系密切。進一步研究證明血漿中miR-let-7f and miR-30e-3p的 聯(lián)合檢測可鑒別NSCLC患者疾病分期，為能否手術(shù)治療提供治療依據(jù)。2013年Skrzypski等〔50〕發(fā)現(xiàn)血清中miR-128,miR-10b,miR-502-3p 和miR-192 等4種miRNAs在不同組織分型的NSCLC患者中存在表達差異，因此認(rèn)為上述4種miRNAs的檢測對于肺鱗癌及肺腺癌的鑒別有重要意義。Powrózek等〔36〕提出血漿及血清中miR-944,miR-3662水平在晚期肺癌患者中會顯著增高，通過檢測miR-944的表達水平可篩選出能夠接受手術(shù)的SCC患者，而miR-3662水平則可篩選可接受手術(shù)的ADC患者。最近另有研究表明，血漿/血清中miR-1254,574-5p,126,183,328,18a,339,140等均異常高表達于分期較早的NSCLC的患者〔51〕，而miR-30c-1,616,146b,566,550,939,150等的高水平表達幾乎均見于肺腺癌的患者〔52〕。

4.2 血清/血漿miRNAs與肺癌的治療及預(yù)后 近幾年大量關(guān)于血漿、血清miRNAs檢測的研究旨在明確外周血miRNAs的各種變化在惡性腫瘤患者治療及預(yù)后中的應(yīng)用，早前許多研究利用體外細(xì)胞培養(yǎng)或動物實驗證實了某些miRNAs水平的改變可通過作用于腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來影響腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化、血管生成從而影響腫瘤轉(zhuǎn)移以及侵襲等與惡性腫瘤患者治療及預(yù)后密切相關(guān)的生物學(xué)行為。Wang等〔41〕的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中IL-1β水平增高，體外實驗中也已經(jīng)闡明了高水平的IL-1β促進腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移的機制。血清中高水平的IL-1β可以通過IL-1β-COX2-H2F1alpha通路降低血清中的miR-101水平，從而導(dǎo)致miR-101表達沉默促使Lin28B蛋白表達增高促進了腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。因此，研究者指出阿司匹林等作為非甾體抗炎藥可以抑制COX-2從而阻斷IL-1β-COX2-H2F1alpha通路，使miR-101受到保護而抑制腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。此外，miR-101表達水平增高可使E2H2，COX2、STMN1及ROCK2水平降低，導(dǎo)致Rho/Rac GTP酶活性顯著降低從而抑制腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化(EMT)以及血管生成過程，并能夠在體內(nèi)及體外抑制腫瘤的發(fā)生及進展。目前關(guān)于肺癌患者治療療效與miRNAs檢測的研究還相對較少，而多集中于對miR-21的研究，多個研究認(rèn)為miR-21表達水平的異常與鉑類藥物的耐藥密切相關(guān)，而對于伴有EGFR突變的NSCLC患者來說，高水平miR-21的表達則預(yù)示更好的EGFR-TKIs藥物療效，這將對臨床中肺癌患者對二、三線應(yīng)用EGFR-TKIs藥物的選擇具有重要指導(dǎo)價值，但遺憾的是這類患者往往預(yù)后較差，OS及DFS明顯短于miR-21表達水平正常的患者〔53〕。此外，偶有研究顯示miR-22的高水平表達與培美曲塞的耐藥相關(guān)〔29〕。關(guān)于肺癌患者的預(yù)后問題，2010年Hu等〔39〕應(yīng)用新一代測序方法發(fā)現(xiàn)了血漿中miR-486,30d,1,499等表達水平的變化與NSCLC患者的OS密切相關(guān)。隨后有研究發(fā)現(xiàn)miR-let7f以及miR-30e-3p的異常低水平表達提示了NSCLC患者的不良預(yù)后〔30〕。隨著研究的深入，Zheng等〔46〕進一步發(fā)現(xiàn)，已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者，其血漿中miR486-5p,660,92a,155以及miR-197的表達水平均明顯高于未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者。而Patnaik等〔47〕發(fā)現(xiàn)miR-124-5p,146b-3p,200b-5p,30c-1-3p,miR-510,585,630,657,708等的表達水平與Ⅰ期NSCLC術(shù)后患者的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。目前關(guān)于血漿/血清中miRNAs檢測應(yīng)用于肺癌診斷、療效監(jiān)測以及預(yù)后預(yù)測的價值毋庸置疑，但鮮有研究發(fā)現(xiàn)某種單一miRNAs可作為NSCLC患者診斷、治療、預(yù)后中的獨立影響因素，而Yuxia等〔44〕在2012年的一項臨床研究指出，血清中miR-125b的表達差異可以作為判定NSCLC患者OS的獨立預(yù)后因素，并指出高水平表達miR-125b的患者預(yù)后較差，OS明顯縮短。最近，Li等〔45〕對37例NSCLC患者手術(shù)切除標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞進行了體外細(xì)胞實驗，驗證了miR-125b表達差異對NSCLC患者預(yù)后的指示作用。該體外實驗指出，miR-125b表達水平的變化可通過調(diào)控TP53基因的表達，從而改變腫瘤細(xì)胞中TP53INP1蛋白水平，在分化較差的腫瘤標(biāo)本中，伴隨miR-125b的高水平表達，TP53INP1蛋白水平明顯降低，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲等生物學(xué)行為的發(fā)生。

5 問題與展望

綜上，miRNAs的起源及其在血漿、血清中的穩(wěn)定性已基本得到詮釋，但關(guān)于miRNAs如何通過血液進行運輸，如何進入靶細(xì)胞發(fā)揮其作用等一系列的問題仍不明確。血清、血漿中的miRNAs可以在各種極端環(huán)境下穩(wěn)定存在，這為臨床中惡性腫瘤患者的液體活檢提供了可行性理論依據(jù)。由于血漿/血清miRNAs的無創(chuàng)、低耗、高效的檢測特點，近年來此類研究逐漸增多，越來越多的miRNAs作為惡性腫瘤生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，但關(guān)于不同miRNAs在各種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中影響腫瘤生長、上皮間質(zhì)化、血管生成、轉(zhuǎn)移以及侵襲性等生物學(xué)行為的機制尚未完全明確，未來有待更多體外細(xì)胞系、動物實驗等相關(guān)研究的理論支持以及大樣本臨床研究的驗證。另外，關(guān)于血清/血漿中miRNAs的檢測問題，基因芯片目前大多應(yīng)用于靶miRNAs的初篩，但由于其價格昂貴、重復(fù)性差，因此應(yīng)用該方法檢測miRNAs的樣本數(shù)往往較少，實驗結(jié)論并不完全可靠，需要應(yīng)用RT-PCR的方法在大樣本研究中予以進一步驗證。因此，未來想要在臨床診療中開展惡性腫瘤的液體活檢，我們還需要建立從液體活檢標(biāo)本采集到抽提、檢測等一系列標(biāo)準(zhǔn)化程序，從而為未來患者早期篩查、精確診斷、病情監(jiān)測提供無創(chuàng)、低耗、高效的檢測方法。

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〔2017-01-09修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

吉林省衛(wèi)生與計劃生育委員會部屬醫(yī)院臨床學(xué)科重點項目資助項目(201133)

李 薇(1957-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事血液腫瘤診斷治療研究。

劉雪蓮(1990-)，女，在讀碩士，主要從事血液腫瘤診斷治療研究。

R730.43

A

1005-9202(2017)11-2843-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.107