馬玉濱 燕 速 于鵬杰 趙林娟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，青海 西寧 810016)

·腫 瘤·

河湟谷地胃癌患者癌組織生長抑素受體2和CCL7蛋白的表達(dá)及臨床意義

馬玉濱 燕 速 于鵬杰 趙林娟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，青海 西寧 810016)

目的 研究河湟谷地胃癌患者癌組織及癌旁組織中生長抑素受體(SSTR)2和細(xì)胞趨化因子(CCL)7蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。方法 收集河湟谷地新發(fā)胃癌患者癌組織及癌旁組織各60例，免疫組化法檢測SSTR2和CCL7蛋白的表達(dá)情況，分析不同臨床病理參數(shù)對SSTR2和CCL7陽性表達(dá)的影響以及二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 SSTR2在胃癌組的陽性表達(dá)率較癌旁組低(P<0.05)；CCL7在胃癌組的陽性表達(dá)率較癌旁組明顯升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高、中分化胃癌組中SSTR2的陽性表達(dá)率明顯高于低分化胃癌組(P<0.05)；有漿膜浸潤、腫瘤直徑大、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者的CCL7陽性表達(dá)率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無漿膜浸潤、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移以及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)。SSTR2和CCL7在胃癌組織中的表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 SSTR2的缺失和CCL7的高表達(dá)可能促進(jìn)河湟谷地胃癌的發(fā)生。

SSTR2；CCL7；胃癌；河湟谷地

盡管世界大部分地區(qū)胃癌的發(fā)生率已經(jīng)有明顯下降，但在我國仍是第二位的癌癥死因，尤其在我國西北部地區(qū)〔1，2〕。作為西北青藏高原上的省份之一，青海省平均海拔在3 000 m以上，是我國胃癌的高發(fā)地區(qū)〔3〕。河湟谷地位于青海省東部，位于黃河上游與湟水河流域之間，海拔相對較低，平均約2 000 m，是青海省主要農(nóng)業(yè)區(qū)，人口稠密。研究顯示近10年來河湟谷地胃癌的檢出率及死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，且呈現(xiàn)出特殊的流行病學(xué)特征——高侵襲性，該地區(qū)胃癌具有高病死率主要是因?yàn)樵摰貐^(qū)的進(jìn)展期腫瘤容易侵犯神經(jīng)及脈管〔4〕。生長抑素(SST)是一種能夠抑制垂體釋放生長激素的環(huán)狀多肽類激素，主要通過5種生長抑素受體(SSTR)發(fā)揮作用〔5〕，其中SSRT2還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在腫瘤組織中呈低表達(dá)，并與患者預(yù)后相關(guān)〔6，7〕。但對胃癌中SSRT2變化的報(bào)道不多，且結(jié)果不盡相同〔8～12〕。此外，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，細(xì)胞趨化因子(CCL7)起著重要作用，通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面受體CCR1、CCR3增加腫瘤侵襲性〔13〕。但在胃癌方面，僅有1篇報(bào)道認(rèn)為CCL7在胃癌組織中高表達(dá)，與患者不良預(yù)后有關(guān)〔14〕。本文探討SSTR2和CCL7在河湟谷地胃癌患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 對2015年3～10月青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科住院的病人進(jìn)行篩選，選取世居于河湟谷地、經(jīng)纖維胃鏡檢查，取病理活檢明確診斷為胃癌，且接受胃癌根切手術(shù)者60例，年齡46～75〔平均(55.5±7.1)〕歲，男33例，女27例；腫瘤直徑<5 cm者37例，≥5 cm者23例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期21例；腫瘤組織分化程度：高、中分化組26例，低分化組34例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；漿膜浸潤24例。術(shù)中取胃癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁非腫瘤黏膜組織(距腫瘤邊緣>5 cm)置10%～13%甲醛溶液中固定，石蠟包埋備用。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：性別不限；有完整的臨床病理資料；世居青海省河湟谷地(兩代及兩代以上)；新發(fā)原發(fā)性胃癌病例；可接受根治性手術(shù)治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受過放化療治療；合并免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)疾病等。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 HE染色 ①修整蠟塊，連續(xù)勻速切片，每片厚度約4 μm，溫水中展平，放到經(jīng)過預(yù)處理的載玻片上，烘干；②二甲苯及乙醇梯度處理，對石蠟切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水；③蘇木精液染色；④1%鹽酸乙醇分色；⑤自來水浸泡15 min至反藍(lán)；⑥將切片置伊紅染色液中1～3 min，蒸餾水稍洗；⑦常規(guī)脫水，透明；⑧中性樹脂封片，鏡檢。

1.3.2 免疫組化法 ①切片、脫蠟、復(fù)水：同HE染色。②抗原微波修復(fù)：枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)(中低火)10 min，室溫冷卻至常溫，重復(fù)一次；3%H2O2，10 min；PBS液洗3次。③封閉：封閉液(PBS，5% BSA+0.3% Triton X-100)室溫孵育1 h。④孵育抗體：加入適量一抗(SSTR-2兔源一抗購自Abcam公司，用封閉液以1∶100稀釋；CCL-7兔源一抗購自SAB公司，用封閉液以1∶20稀釋)4℃過夜，PBS液洗3次；辣根酶標(biāo)記的二抗(羊抗鼠IgG-HRP，購自Jackson ImmunoResearch，用封閉液以1∶500稀釋)室溫孵育2 h；PBS液洗3次。⑤DAB溶液顯色，觀察至顯色滿意，流動水沖洗終止顯色；⑥蘇木素復(fù)染10 s，1%氨水退紫，梯度酒精脫水，二甲苯透明。⑦中性樹膠封片，鏡檢。⑧質(zhì)量控制：用試劑公司所提供的已知結(jié)果為陽性的切片作為陽性對照；陰性對照組則用PBS液替代一抗。

1.4 結(jié)果判定 使用隨機(jī)選取的5個高倍鏡(×400)進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)觀察患者的癌細(xì)胞和癌旁正常胃黏膜上皮細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)和著色深度，并進(jìn)行計(jì)分。共設(shè)定為0～4分，0分代表陰性表達(dá)，1分代表陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤10%，2分代表陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)在11%～50%，3分代表陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)在51%～75%，陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)超過75%為4分。同時根據(jù)陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度進(jìn)行區(qū)分：0分代表基本不著色，1分代表淡黃

色，2分代表棕黃色，3分代表棕褐色。統(tǒng)計(jì)的分?jǐn)?shù)相乘，得數(shù)≤3分的計(jì)為表達(dá)陰性(-)，得數(shù)>3的則為表達(dá)陽性(+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。

2 結(jié) 果

2.1 SSTR2和CCL7蛋白在胃癌與癌旁組織中的表達(dá) SSTR2和CCL7蛋白在免疫組化染色中呈現(xiàn)棕褐色顆粒，在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜內(nèi)表達(dá)。見圖1。胃癌組織中，SSTR2表達(dá)陽性28例(46.7%)，癌旁組織中，SSTR2表達(dá)陽性44例(73.3%)，二者差異顯著(χ2=8.889，P=0.003)。胃癌組織中CCL7表達(dá)陽性33例(55.0%)；癌旁組織CCL7表達(dá)陽性17例(28.3%)，二者差異顯著(χ2=8.777，P=0.003)。見圖2。

圖1 胃癌及癌旁組織HE染色(×400)

2.2 胃癌組織中SSTR2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 SSTR2在低分化胃癌組織中的陽性表達(dá)率較高、中分化胃癌組織明顯降低(P<0.05)；SSTR2的陽性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.3 胃癌組織中CCL7的陰性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌患者中CCL7的陽性表達(dá)與性別、年齡、腫瘤分化程度無明顯的關(guān)系(P>0.05)，與腫瘤大小、癌組織浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.4 SSTR2和CCL7在胃癌中表達(dá)的相關(guān)性 在SSTR2表達(dá)陽性的胃癌組織中，CCL7陽性表達(dá)率為60.7%(17/28)，在所有SSTR2的表達(dá)為陰性胃癌組織中，CCL7陽性表達(dá)率為50.0%(16/32)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.693,P=0.405)，表明二者在胃癌組織中的表達(dá)無相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

對于胃癌組織中SSTR2的研究不多，結(jié)果也有出入。武華等〔8〕研究指出，SSTR的表達(dá)具有多樣性，多種亞型SSTR可以在胃癌組織和胃良性組織中檢測出表達(dá)結(jié)果，而SSTR2在胃癌組織中表達(dá)比較低，但與患者性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均未見明顯相關(guān)；與高分化胃癌相比，低分化胃癌組織中SSTR的表達(dá)降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。江興松等〔9〕認(rèn)為SSTR2與胃癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌分化程度有關(guān)。但楊曉莉等〔10〕則發(fā)現(xiàn)SSTR2在胃癌及癌旁組織均低表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。范學(xué)科等〔11〕在基因和蛋白水平的研究得出同樣結(jié)論。梁君銘等〔12〕則表明，SSTR2在胃正常組織的陽性表達(dá)率明顯高于胃癌組織，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Liu等〔13〕也有類似發(fā)現(xiàn)，且在胃癌組織中尤其是低分化的胃癌組織中SSTR的表達(dá)相對更低。CCL7是CC趨化因子亞族一員，主要在內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等表達(dá)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后經(jīng)過系列的加工和修飾，分泌至胞外，發(fā)揮的作用包括趨化作用、引發(fā)鈣內(nèi)流、肝素結(jié)合等〔14〕。免疫組化法和RT-PCR法顯示大腸癌肝轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞CCL7的表達(dá)明顯高于正常腸上皮細(xì)胞，推測CCL7在促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起到相當(dāng)重要的作用〔15〕，對于胃癌與CCL7相關(guān)性的報(bào)道很少。

本文結(jié)果提示SSTR2的缺失可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。SSTR2屬于特異性的生長抑素受體，受SST、SSTA激活后可能通過環(huán)腺苷酸、促分裂原活化蛋白激酶、鈣離子依賴性蛋白激酶等途徑發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；也可通過抑制促腫瘤生長的細(xì)胞因子或激素的合成與分泌，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤血管形成〔6，7〕。因此推測由于SSTR2的低表達(dá)，影響了上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，SST抑制胃黏膜細(xì)胞增殖的能力下降，凋亡細(xì)胞減少，這可能是胃癌發(fā)生的原因之一。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SSTR2在河湟谷地胃癌組織中的低表達(dá)與分化程度密切相關(guān)，分化程度越高，SSTR2陽性表達(dá)率越高，而與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)。據(jù)此認(rèn)為，胃癌的惡性程度與SSTR2有關(guān)聯(lián)，且SSTR2可能具有調(diào)控胃癌組織分化的作用，在胃癌的發(fā)展中起到一定作用。然而研究發(fā)現(xiàn)，SSTR2在胃癌中的表達(dá)與其是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與江興松等〔9〕的結(jié)論相悖，這有待大樣本數(shù)據(jù)的進(jìn)一步確認(rèn)。

本文提示CCL7的表達(dá)上調(diào)可能在胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程起到了一定的作用，這與Hwang等〔14〕的研究結(jié)果相同。惡性腫瘤的侵襲是一個復(fù)雜的過程，多數(shù)情況下，與細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞周圍結(jié)締組織的降解及破壞有關(guān)，而CCLs表達(dá)水平的增加可募集髓樣細(xì)胞至腫瘤病灶處，這些髓樣細(xì)胞分泌MMP9、MMP2，可通過破壞組織學(xué)屏障、促進(jìn)新生血管形成等促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究提示CCL7在胃癌的進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用。

此外，SSTR2和CCL7在胃癌患者中的表達(dá)無相關(guān)關(guān)系，可能二者在胃癌中表達(dá)受到的影響因素不同，也可能是本次實(shí)驗(yàn)選取的樣本較少或使用的實(shí)驗(yàn)方法不同導(dǎo)致。因此，下一步擬擴(kuò)大樣本量，應(yīng)用PCR法從DNA水平驗(yàn)證，并通過基因轉(zhuǎn)染及免疫印跡法探討SSTR2和CCL7在胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移中可能涉及的信號途徑。

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〔2017-03-15修回〕

(編輯 曹夢園)

馬玉濱(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)11-2713-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.049