朱小兵 吳 論

(中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東 中山 528400)

利多卡因?qū)δI缺血再灌注大鼠心肌組織C-Jun氨基末端激酶和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶表達的影響

朱小兵 吳 論

(中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東 中山 528400)

目的 評價利多卡因預先給藥對腎缺血再灌注(I/R)大鼠心肌組織C-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)表達的影響。方法 健康Wistar大鼠36只，體重300～350 g，采用隨機數(shù)字表法分為3組(n=12)：假手術(shù)組(S組)只分離腎動脈不夾閉；I/R組，雙腎缺血60 min、恢復灌注4 h建立大鼠I/R損傷模型；利多卡因預先給藥組(L組)夾閉雙側(cè)腎動脈前60 min時前靜脈注射利多卡因5 mg/kg，隨后以2 mg·kg-1·h-1速率靜脈輸注60 min；S組和I/R組給予等容量生理鹽水。再灌注4 h時取心臟血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測定心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度，隨后處死大鼠，取心肌組織，測定心肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用Western法測定心肌細胞JNK和ERK的表達水平，光鏡下觀察心肌組織及腎組織病理學改變。結(jié)果 光鏡下可見I/R組呈明顯心肌及腎組織損傷的形態(tài)學變化，L組心肌組織及腎組織損傷明顯減輕。與S組比較，I/R組心肌組織JNK及ERK表達水平升高，血清cTnI濃度、心肌MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與I/R組比較，L組心肌組織JNK表達水平降低，ERK表達水平升高，血清cTnI濃度、心肌MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)。結(jié)論 利多卡因預先給藥可減輕I/R大鼠心肌損傷，其機制可能與激活MAPK信號傳導通路，上調(diào)ERK和下調(diào)JNK表達有關(guān)。

再灌注損傷；利多卡因；腎臟；心肌

腎缺血再灌注(I/R)損傷是臨床腎移植術(shù)中急性腎衰竭的重要誘因，其發(fā)生機制涉及氧自由基致細胞損傷、細胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙、白細胞激活及血小板聚集等多種病理生理過程。腎I/R時產(chǎn)生的氧自由基、細胞因子及黏附分子等大量進入體循環(huán)，造成遠隔器官如心臟的損傷〔1〕。本課題組前期研究表明，利多卡因可減輕腎I/R大鼠心肌組織損傷〔2〕，但其具體機制尚不明確。本研究觀察利多卡因預先給藥對腎I/R大鼠心肌組織C-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組 健康Wistar大鼠36只〔動物合格證號：scxkc(甘)2004-0006-0000413〕，甘肅省中醫(yī)學院動物實驗中心提供，體重300～350 g，采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(S組)，腎I/R組和利多卡因預先給藥組(L組)各12只。

1.2 大鼠腎臟I/R模型的制備 實驗室溫度25℃，大鼠實驗前禁食12 h，自由進水。腹腔注射3%戊巴比妥50 mg/kg麻醉下，股靜脈穿刺置管，注射肝素400 U/kg后，輸注林格氏液20 ml·kg-1·h-1。參照文獻〔2～4〕采用夾閉雙腎動脈60 min再灌注的方法建立大鼠腎臟I/R模型。于脊柱兩旁0.5 cm肋弓下0.5 cm各縱向切開皮膚1 cm，鈍性分離腰大肌，暴露雙側(cè)腎臟，分離腎動脈，用無創(chuàng)動脈夾閉雙側(cè)腎動脈，腎臟由紅褐色短時間內(nèi)變成蒼白色再逐漸變成暗紫色為缺血成功的標志；60 min后松開動脈夾，恢復血流灌注，腎臟由暗紫色變?yōu)榧t褐色為再灌注成功的標志。若松開動脈夾5 min后，腎臟仍未轉(zhuǎn)變?yōu)榧t褐色，則為再灌注未成功，剔出本研究。

1.3 分組處理 I/R組夾閉雙側(cè)腎動脈60 min、恢復灌注4 h建立大鼠腎臟I/R損傷模型；L組夾閉雙側(cè)腎動脈前60 min靜脈注射5 mg/kg利多卡因，隨后以2 mg·kg-1·h-1速率靜脈輸注60 min。

1.4 標本采集及處理 術(shù)后再灌注4 h時，經(jīng)心臟抽取血樣3 ml，肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清，于-70℃凍存，采用雙抗體夾心法測定血漿心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度，試劑盒由德國Roche公司提供。采血后迅速摘取心臟，于冰板上留取相同部位左心室前壁心肌組織，按重量體積比加冰生理鹽水制備10%的組織勻漿，低溫低速離心15 min后取上清液，采用硫代巴比妥法測定心肌丙二醛(MDA)含量，采用黃嘌呤氧化酶法測定心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。心肌組織中心尖部組織和左腎皮質(zhì)置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制成厚6 μm的連續(xù)切片，取三張鄰片進行展片，共展三套切片，進行蘇木精-伊紅染色(HE)，在光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學改變。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠腎組織病理學比較 光鏡下S組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整；I/R組腎小管上皮細胞水樣和氣球樣變性，管腔內(nèi)中性粒細胞浸潤，上皮細胞扁平，腎間質(zhì)充血、水腫；L組腎小管腫脹為主，腎小管上皮細胞水樣變和氣球樣變輕微，無明顯壞死細胞，病理學損傷輕于I/R組。見圖1。

2.2 三組大鼠心肌組織病理學比較 光鏡下S組心肌組織纖維排列整齊，細胞核均勻一致，紋理清晰；I/R組心肌細胞腫脹，心肌纖維部分變形，斷裂，排列混亂，橫紋模糊甚至消失，細胞核增大、淡染；L組心肌組織血管輕度擴張，纖維排列整齊，間隙減小，細胞輕度腫脹，病理學損傷輕于I/R組。見圖2。

圖1 三組大鼠腎組織病理學比較(HE,×400)

圖2 三組大鼠心肌組織病理學比較(HE,× 400)

2.3 三組大鼠血清cTnI濃度、心肌MDA含量、SOD活性比較 與S組比較，I/R組血清cTnI濃度、心肌MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與I/R組相比，L組血清cTnI濃度、心肌MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠血清cTnI濃度、心肌MDA含量、 SOD活性的比較

與S組比較:1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05，下表同

2.4 三組心肌組織JNK及ERK表達水平的比較 與S組比較，I/R組心肌組織JNK及ERK表達水平升高；與I/R組相比，L組JNK及ERK表達水平均降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組心肌組織JNK及ERK表達水平比較

3 討 論

cTnI是橫紋肌收縮的重要調(diào)節(jié)蛋白，特異性存在于心肌細胞中，心肌細胞完整狀態(tài)下，cTnI不能透過細胞膜進入血循環(huán)，當心肌缺血缺氧，發(fā)生變形或壞死，細胞膜受損時，cTnI因其分子量較小而彌散進入細胞間質(zhì)，從而較早地釋放至外周血，是診斷心肌損傷的敏感性和特異性指標〔5〕。本研究結(jié)果提示腎I/R導致一定程度的心肌損傷。利多卡因預先給藥后大鼠血清cTnI濃度、心肌MDA含量降低，SOD活性升高，提示利多卡因可減輕大鼠腎臟I/R所致心肌組織損傷。ERK和JNK是MAPK家族中兩個重要成員。JNK磷酸化水平升高可導致細胞凋亡增加，ERK可調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育及細胞分裂。ERK和JNK通路是兩條作用相反的路徑，兩者間平衡是決定細胞生存或壞死及凋亡的關(guān)鍵因素〔6〕。本研究結(jié)果表明，靜脈注射利多卡因5 mg/kg，隨后以2 mg·kg-1·h-1速率靜脈輸注60 min可減輕大鼠腎I/R大鼠心肌組織損傷，其機制可能是利多卡因可與細胞膜上受體結(jié)合，激活PAPK通道，促進ERK表達上調(diào)，JNK表達下調(diào)，通過G蛋白耦聯(lián)受體信號途徑介導的核反應，減少心肌細胞壞死有關(guān)。綜上所述，利多卡因預處理可一定程度減輕大鼠腎I/R所致心肌損傷，其機制可能與激活MAPK信號傳導通路，上調(diào)ERK和下調(diào)JNK表達有關(guān)。

1 卜勇軍,楊靜靜,劉素芳,等.大豆異黃酮對糖尿病大鼠神闕穴再灌注損傷的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012；32(2):309-11.

2 朱小兵,石翊颯,劉 樺,等.利多卡因預處理對腎臟缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響〔J〕.實用醫(yī)學雜志,2010；26(8):1320-2.

3 田 蕾,孫洞簫.氟伐他汀對大鼠腎缺血再灌注損傷P27和PCNA表達的影響〔J〕.實用醫(yī)學雜志,2011；27(18):3284-5.

4 朱小兵,劉志群,吳 論,等.mito-KATP通道在利多卡因預先給藥減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用〔J〕.中華麻醉學雜志,2013；33(11)：1322-5.

5 黃小媛,湯勇才,廖 軍.敏感型心肌鈣蛋白I早期診斷急性心肌梗死的應用研究〔J〕.實用醫(yī)學雜志,2012；28(14):2448-9.

6 陳主初,王樹人.病理生理學〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,2001:74.

〔2015-11-30修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

吳 論(1963-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事麻醉藥理學研究。

朱小兵(1980-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事麻醉與器官保護相關(guān)研究。

R33

A

1005-9202(2017)11-2644-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.019