汪自然 鄭吼真 劉仕欣 陳 瑞 廖文華 林 琳

(廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 511300)

慢性阻塞性肺疾病患者血清調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與PD-1+T細(xì)胞的協(xié)同抑制效應(yīng)

汪自然 鄭吼真1劉仕欣 陳 瑞1廖文華1林 琳1

(廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 511300)

目的 探討在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)PD-1+T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞功能的特征及其之間的相關(guān)性。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)分析COPD患者及健康人外周血中Treg、效應(yīng)T細(xì)胞的比例；分析相關(guān)細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ，白細(xì)胞介素(IL)-17水平。體外抑制實驗檢測Treg細(xì)胞免疫抑制能力，阻斷PD-1后檢測T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。流式細(xì)胞術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測血漿中促炎和免疫抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生情況。結(jié)果 相比健康人群，COPD患者外周血中Treg細(xì)胞水平與表達(dá)PD-1的失能效應(yīng)T細(xì)胞水平都升高。COPD患者外周血中Treg產(chǎn)生的細(xì)胞因子，包括IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β都升高。在COPD患者外周血中，通過抑制T細(xì)胞的PD-1可以導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ與TGF-β的能力顯著上升。結(jié)論 在COPD患者中，免疫抑制細(xì)胞Treg與失能的PD-1+T細(xì)胞會導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的功能失調(diào)。

Treg細(xì)胞；慢性阻塞性肺疾病；PD-1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的病因目前認(rèn)為與吸煙、粉塵、空氣污染、呼吸道感染等有關(guān)。在COPD病程中，由細(xì)菌與病毒相關(guān)的慢性與急性感染可以誘導(dǎo)炎癥，對COPD的病理進(jìn)程有重要作用〔1〕。病毒與細(xì)菌對COPD中的淋巴細(xì)胞激活具有重要作用，包括Th1與CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)〔2，3〕。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是CD4+T細(xì)胞的一個亞群，通過釋放免疫抑制性細(xì)胞因子〔如白細(xì)胞介素(IL)-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等〕在控制炎癥性的免疫應(yīng)答與效應(yīng)T細(xì)胞功能中起著重要作用〔4，5〕。在許多種類的炎癥疾病中都發(fā)現(xiàn)了Treg數(shù)目的變化〔6～9〕。關(guān)于Treg細(xì)胞在COPD、肺部疾病、外周血中的報道目前很少，特別是關(guān)于在COPD中Treg的功能研究。PD-1是效應(yīng)T細(xì)胞上的一個負(fù)向調(diào)控共刺激分子，在持續(xù)的炎癥性免疫應(yīng)答中表達(dá)會上調(diào)，通過與之配體相互作用，抑制外周組織中的持續(xù)免疫反應(yīng)，并且阻止自身組織受到免疫損傷〔10〕；PD-1還通過上調(diào)IL-10誘導(dǎo)凋亡，引起效應(yīng)T細(xì)胞的功能失調(diào)，從而破壞免疫應(yīng)答〔11，12〕。本文探討在COPD中Treg細(xì)胞功能失調(diào)是否與表達(dá)PD-1的效應(yīng)T細(xì)胞有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 血樣本 肝素化的外周血樣本來自于95例固定的COPD患者，男50例，女45例，年齡30～82歲，平均(50.7±7.3)歲；文化程度：初高中53例，大學(xué)及以上42例；均符合 2006年版COPD全球倡議(GOLD)中關(guān)于COPD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另有健康者35例為對照組，年齡32～85歲，平均(52.4±7.8)歲；文化程度：初高中18例，大學(xué)及以上17例。COPD患者均有超過10年的煙齡，在抽血實驗期間病情沒有惡化，沒有其他肺部疾病等，能夠正常完成研究調(diào)查。對照組為不吸煙者，肺部功能正常，沒有氣管方面的疾病。本研究經(jīng)倫理委員會審核批準(zhǔn)且實驗者簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 T細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，10%FBS (Gibco 900-108)，青霉素/鏈霉素溶液 (Gibco 15140-122)，2-巰基乙醇 (Invitrogen 21985-023)。流式細(xì)胞學(xué)檢查儀器：分析儀器：BD LSRFortessa；分選儀器：BDFACSAria Ⅱ；流式熒光抗體購于biolegend公司。ELISA檢測試劑盒購自eBioscience公司。SYBR Green：TAKARA公司。流式細(xì)胞學(xué)檢查數(shù)據(jù)分析軟件采用Flowjo Version 9。

1.3 外周血單細(xì)胞懸液制作 外周血單核細(xì)胞采用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Uppsala，Sweden) 分離，進(jìn)行密度梯度離心〔13〕。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備 將分離得到的細(xì)胞置于1 ml T細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入50 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素，在37℃培養(yǎng)箱中刺激0.5 h后加入 2 μmol/L莫能菌素，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。流式細(xì)胞術(shù)抗體標(biāo)記：(1)表面抗體標(biāo)記：將細(xì)胞重懸在100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細(xì)胞加0.6 μl流式抗體，置于4℃冰箱中避光孵育25 min，用2 ml PBS洗1～2次。(2)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞因子與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的標(biāo)記：使用Ebioscience公司胞質(zhì)與核固定液，按照說明書進(jìn)行固定和標(biāo)記。

1.5 Treg細(xì)胞抑制實驗 流式細(xì)胞術(shù)分選出效應(yīng)T細(xì)胞(CD4+CD25-CD127+)，用3 μg或6 μg無內(nèi)毒素的P6脂蛋白進(jìn)行刺激，然后加入或者不加入流式細(xì)胞術(shù)分選出的自體的Treg細(xì)(CD4+CD25+CD127-)。效應(yīng)T細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例為2∶1，然后觀察淋巴細(xì)胞的增殖情況〔14〕。

1.6 RT-PCR檢測 將分離得到的細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成CDNA，用SYBR Green 進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Graph Pad Prism 5.0軟件行非配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 COPD患者外周血中的免疫抑制細(xì)胞表達(dá)升高 COPD患者外周血中CD4+FOXP3+比例明顯升高，從8.95%±1.05%上升到12.1%±1.53%，CD4+CD25+CD127-FOXP3+Treg細(xì)胞比例也明顯增多由3.83%±0.62%升到7.93%±0.81%；Treg細(xì)胞的總數(shù)也有明顯增高(P<0.001)。

2.2 COPD患者Treg細(xì)胞對效應(yīng)T細(xì)胞有更強的抑制作用 COPD患者相比健康人群PD-1+CD127+T細(xì)胞的比例(COPD組：23.97%±4.72%，健康人群9.36%±2.84%)與表達(dá)強度(COPD組：82.58±9.35,健康人群43.68±7.54)明顯升高(P<0.001)。通過免疫抑制實驗，分選COPD患者與健康人群外周血效應(yīng)T細(xì)胞(CD4+CD127+CD25-)，用3 μg/ml或者6 μg/ml的脂蛋白P6進(jìn)行刺激。將效應(yīng)T細(xì)胞分別培養(yǎng)于自體的Treg細(xì)胞(CD4+CD127-FOXP3+)。效應(yīng)T細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例為2∶1。在兩個濃度的P6處理下，COPD患者的效應(yīng)T細(xì)胞增殖能力比健康者差；同時，COPD患者的效應(yīng)T細(xì)胞被Treg細(xì)胞抑制的程度也更高(65%及61%)，相比于健康者(44%及40%)差異顯著(P<0.05)。

2.3 COPD患者細(xì)胞因子分泌失調(diào) IL-10(COPD組113.73±12.93，健康人群13.98±2.55)與TGF-β(COPD組98.35±11.89，健康人群47.36±6.95)的表達(dá)量在COPD患者中都有顯著性增加(P<0.001)。促炎作用的Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子包括IFN-γ(COPD組：56.63±15.48，健康人群43.27±6.39)和IL-12(COPD組59.94±7.69，健康人群33.48±4.85)，在COPD患者中也顯著升高(P<0.01)。

2.4 阻斷免疫檢測點后T細(xì)胞的功能特性變化 加入抗PD-1抗體后，IFN-γ與TGF-β的分泌都明顯升高(P<0.05)。而IL-17與IL-10的分泌沒有明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 阻斷免疫檢測點后T細(xì)胞的功能特性變化檢測(n=25)

與對照組比較：1)P<0.05;與加入抗原組比較：2)P<0.05

3 討 論

本研究提示在COPD患者中，發(fā)揮免疫抑制作用的Treg細(xì)胞與失能的PD-1+T細(xì)胞是導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞功能失調(diào)的主要兩個因素。先前報道了Treg細(xì)胞在肺部、支氣管肺泡灌洗液(BAL)、外周血中的研究〔15～18〕，但是關(guān)于Treg細(xì)胞在COPD中研究的報道還較少。

本文通過FOXP3與CD25來確定抑制性的Treg細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)在COPD中的Treg細(xì)胞具有很強的抑制性功能，能夠抑制自體的效應(yīng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。有研究報道，在慢性吸煙的老鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能可以保護(hù)老鼠的肺部避免受損〔19〕。本研究也說明在COPD中的Treg細(xì)胞具有雙重作用，一方面Treg細(xì)胞可以抑制細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，這些免疫反應(yīng)往往帶來有害的炎癥并且導(dǎo)致發(fā)病；另一方面Treg細(xì)胞會抑制效應(yīng)T細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，從而使病癥持續(xù)。所以，COPD患者抗菌免疫力被兩個重要的因素所限制：一個是效應(yīng)T細(xì)胞的無能，無法對細(xì)菌抗原產(chǎn)生應(yīng)答；另一個是持續(xù)增加的Treg細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞中增加PD-1的表達(dá)是其導(dǎo)致免疫失能的很重要的一個因素，在用PD-1的阻斷抗體后，效應(yīng)T細(xì)胞的功能有了很大的提高。

本研究證實了在COPD患者中免疫抑制的Treg細(xì)胞有顯著的積累，它們可能在肺部中抵消產(chǎn)生炎癥的免疫應(yīng)答。COPD患者中的效應(yīng)T細(xì)胞被抑制，一方面被Treg細(xì)胞抑制，另一方面呈現(xiàn)出失能的表型，從而減弱其抗病毒和抗菌的效應(yīng)功能，阻斷了PD-1后顯著增加了效應(yīng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此，PD-1+細(xì)胞可以作為一個新的靶標(biāo)來治療COPD而找到清除病癥產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞與減輕炎癥反應(yīng)的免疫抑制細(xì)胞之間的平衡，對于治療COPD將大有裨益。

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〔2017-01-06修回〕

(編輯 滕欣航)

廣東省自然科學(xué)基金(No.2016A030313666)

汪自然(1970-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

R56

A

1005-9202(2017)11-2642-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.018

1 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院呼吸內(nèi)科