李 娜 張哲瑩 趙二趁

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺氧誘導因子-2α和多藥耐藥基因1在乳腺癌中的表達及相關性

李 娜 張哲瑩 趙二趁

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的 探討缺氧誘導因子(HIF)-2α和多藥耐藥基因(MDR)1在乳腺癌中的表達及相關性。方法 采用免疫組化和RT-PCR法檢測47例乳腺癌組織和30例癌旁正常乳腺組織中的HIF-2α和MDR1蛋白和mRNA的表達及其相關性。低氧培養(yǎng)建立乳腺癌MCF-7細胞缺氧模型，應用熒光定量PCR和Western印跡分別檢測每組缺氧模型細胞中HIF-2α和MDR1蛋白和mRNA的表達及其相關性。 結果 在乳腺癌組織中HIF-2α蛋白的陽性表達率(76.7%)和MDR1蛋白的陽性表達率(80.0%)均顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)；在乳腺癌組織中HIF-2α mRNA的表達水平(0.896±0.012)和MDR1 mRNA的表達水平(0.884±0.016)均顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)；乳腺癌組織中HIF-2α及MDR1蛋白及mRNA的表達均呈正相關(P均<0.05)。在缺氧組，隨著缺氧時間的延長MCF-7細胞中MDR1的表達均逐漸增高，且MDR1的表達升高與HIF-2α的表達呈同步化改變。結論 缺氧可通過核轉錄因子HIF-2α上調乳腺癌細胞內MDR1的表達，從而使乳腺癌細胞獲得多藥耐藥性。HIF-2α和MDR1將可能成為逆轉乳腺癌耐藥的新的分子靶點。

乳腺癌；缺氧誘導因子-2α；多藥耐藥基因

化療耐藥是導致惡性腫瘤治療失敗的重要原因，也是困擾惡性腫瘤治療的難題之一。在乳腺癌的治療中也不可避免地會遇到化療耐藥的問題。因此尋求有效的耐藥逆轉劑及探索乳腺癌的耐藥逆轉機制具有重要的研究價值。實體腫瘤微環(huán)境局部缺氧是普遍存在的一種現(xiàn)象〔1〕。缺氧誘導因子(HIF)是與細胞缺氧有關的重要轉錄調節(jié)因子，近年來與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系倍受關注，而關于腫瘤化療耐藥與HIF-2α的關系，國內外相關報道較少。本研究分別以乳腺癌組織和細胞為研究對象，從mRNA及蛋白水平研究MDR1與HIF-2α的表達變化及相關性，進而部分闡明乳腺癌多藥耐藥的形成機制，為逆轉乳腺癌的化療耐藥提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 收集新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院2008年10月至2011年10月手術切除且經病理確診的乳腺浸潤性導管癌標本47例，均為女性，年齡33～82(中位57)歲。術前均未經放、化療及內分泌治療，其中伴腋窩淋巴結轉移27例。另取30例癌旁組織(距癌灶邊緣5 cm)作為對照，年齡32～76(中位54)歲。新鮮標本由DEPC處理后凍存管分裝、液氮運送并立即凍存于-80℃冰箱待用。病例均經兩位以上病理醫(yī)師確診。

1.2 主要試劑及細胞系 HIF-2α兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗人P-糖蛋白(P-gP)多克隆抗體購自深圳晶美生物公司，SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒、PCR試劑盒和TRIzol試劑等均購自美國Invitrogen公司；β-actin 抗體購自美國Santa Cruz公司，引物均由上海英駿生物技術有限公司合成；MCF-7細胞株由本實驗室保存。

1.3 免疫組化染色及結果判定 采用EnVisin兩步法，高溫高壓進行抗原修復， 37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染。PBS代替一抗作為陰性對照。HIF-2α和P-gP陽性顯色均為棕黃色顆粒，HIF-2α主要位于腫瘤細胞質和細胞核，以核周胞質中表達較強。P-gP主要位于腫瘤細胞質和細胞膜，在10×40倍視野下隨機選取8～10個視野，計數(shù)棕黃色染色細胞所占的百分數(shù)，≥10%者為陽性，<10%者為陰性。

1.4 RT-PCR 采用TRIzol裂解組織提取RNA，根據Invitrogen cDNA合成試劑盒說明逆轉錄合成cDNA。本研究所用的引物序列如下：HIF-2α正義鏈：5′-tgaaaacgagtccgaagcc-3′，反義鏈：5′-gtggctgacttgaggttga-3′；MDR1 正義鏈：5′-accaagcggctccgataca-3′，反義鏈：5′-tcattggcgagcctggtagtc-3′；GAPDH正義鏈：5′-attcatc tctcctctccca-3′，反義鏈：5′-gttggtggttggtactgt-3′，預期擴增片段大小分別為342，110和580 bp。取反應產物5 μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像并測定分析。

1.5 缺氧模型的建立 將生長狀態(tài)良好的人乳腺癌細胞系MCF-7細胞置于三氣培養(yǎng)箱(2%O2，5%CO2，93%N2)中低氧培養(yǎng)。分別缺氧12 h，24 h，48 h，缺氧48 h/復氧3 h，根據缺氧時間設立4組，以常規(guī)培養(yǎng)(5%CO2，95%空氣)的MCF-7細胞作為對照。每組平行設置3瓶，重復3次。

1.6 熒光定量RT-PCR 按照Trizol 試劑說明書抽提細胞內的總RNA及逆轉錄為cDNA，總反應體系為50 μl：10×PCR緩沖液 2.5 μl，Taq酶 0.25 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，35 pmol/L 5′和3′引物各1 μl，dNTP混合物0.5 μl，cDNA 模板2.5 μl，去離子水15.75 μl，sybrGreen 染料25 μl。反應條件：94℃×5 min，94℃×1 min、50℃×1 min，72℃延伸5 min，共40個循環(huán)。根據Ct值通過公式2-ΔΔCt進行相對定量分析計算可得HIF-2α和MDR1 mRNA相對表達量。

1.7 Western 印跡 按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白，按BCA蛋白含量檢測試劑盒步驟制作標準曲線，計算樣品蛋白濃度，蛋白上清經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用含1%脫脂奶粉的TBST封閉30 min，加入Ⅰ抗于37℃孵育2 h；加入Ⅱ抗于室溫孵育37℃孵育1 h，電化學發(fā)光(ECL)顯色。顯色結果用軟件Quantity One進行灰度分析，并計算蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行χ2、t檢驗，相關性采用Spearman分析。

2 結 果

2.1 HIF-2α和P-gP蛋白在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達 在乳腺癌組織中HIF-2α蛋白的陽性表達率〔23例(76.7%)〕均顯著高于正常乳腺組織中的表達〔22例(46.8%)，χ2=6.722，P=0.010〕；在乳腺癌組織中的P-gP蛋白陽性表達率〔24例(80.0%)〕亦顯著高于正常乳腺組織中的表達〔27例(57.4%)，χ2=4.165，P=0.041〕，見圖1。

圖1 HIF-2α和P-gP蛋白在不同組織中的表達(DAB，×200)

2.2 乳腺癌組織中HIF-2α和P-gP蛋白表達的相關性 乳腺癌組織中HIF-2α蛋白和P-gP蛋白的表達呈正相關(r=7.873，P=0.005)。

2.3 HIF-2α和MDR1 mRNA在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達 在乳腺癌組織中HIF-2α mRNA的表達水平(0.896±0.012)顯著高于其在正常乳腺組織中的表達(0.664±0.006，t=9.578，P=0.001)；在乳腺癌組織中MDR1 mRNA的表達水平(0.884±0.016)亦顯著高于在正常乳腺組織中的表達(0.626±0.007，t=9.692，P=0.001)，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測HIF-2α和MDR1 mRNA的表達

2.4 乳腺癌組織中HIF-2α和MDR1 mRNA表達的相關性 乳腺癌組織中HIF-2α mRNA和MDR1 mRNA的表達呈正相關(r=5.487，P=0.019)。

2.5 MCF-7細胞株常氧與缺氧條件下HIF-2α和MDR1 mRNA的表達情況 隨著缺氧時間的延長，HIF-2α和MDR1的表達呈逐漸升高趨勢(P<0.05)；復氧后它們的表達又不同程度地減弱(P<0.05)。由此可見，HIF-2α和MDR1的表達之間呈現(xiàn)同步改變。見表1。

表1 在不同缺氧時間點HIF-2α和MDR1 mRNA的 相對表達差異

與對照組比較：1)P<0.05；與前一缺氧時間點比較：2)P<0.05；與復氧3 h組比較：3)P<0.05，下表同

2.6 MCF-7細胞株常氧與缺氧條件下HIF-2α和P-gP蛋白的表達情況 Western印跡結果顯示，隨著缺氧時間的延長，HIF-2α和P-gP蛋白的相對表達量也逐漸增高；但在恢復供氧僅3 h后HIF-2α和P-gP蛋白的表達即開始下降。P-gP蛋白的表達增高與HIF-2α的表達呈同步改變，見表2。

表2 在不同缺氧時間點HIF-2α和P-gP 蛋白的相對表達量

3 討 論

絕大多數(shù)實體腫瘤包括乳腺癌在內存在缺氧微環(huán)境。在缺氧微環(huán)境中腫瘤的新生血管生成、能量代謝、細胞增殖和轉移等相關基因的表達受到缺氧誘導因子的調節(jié)〔2，3〕。缺氧也同時加劇了腫瘤細胞的基因不穩(wěn)定性，一些腫瘤生存因子被激活，造成了腫瘤細胞的化療耐受，促進了腫瘤細胞的轉移，進而影響了患者的預后〔4〕。因此，腫瘤的缺氧微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移和預后之間關系密切，這一領域也將成為尋找腫瘤新治療方法的研究熱點。

MDR是腫瘤患者進行有效化療的主要障礙之一，也是腫瘤患者化療急需解決的難題。MDR1編碼的P-gP過度表達是產生耐藥的主要機制，其可將進入細胞內的抗癌藥物主動泵出細胞外，細胞內的藥物積聚被減少，使大多數(shù)實體腫瘤，如結腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等產生耐藥〔5〕。

HIF-2α是調節(jié)腫瘤血管形成、增殖凋亡、糖代謝及化療耐藥等多種相關基因表達的重要轉錄因子，與HIF-1α具有48%的結構同源性，受氧水平調節(jié)〔6〕；低氧微環(huán)境導致腫瘤對化療藥物耐藥的機制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中HIF-2α和P-gP蛋白及mRNA的表達均顯著高于正常乳腺組織，且二者表達正相關。吳倩等〔7〕研究結果顯示，靶向HIF-2α的siRNA表達載體能夠有效阻遏HIF-2α基因的表達，抑制P-gP蛋白的表達，從而逆轉肺腺癌A549細胞對順鉑的化療耐藥性。Chen等〔8〕在對結腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α 通過下調MDR1/P-gP表達逆轉多藥耐藥。由此可見，HIFs可能通過上調P-gP表達，在包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤化療耐藥機制及進展中發(fā)揮重要作用，其確切機制尚不完全清楚，有待于深入研究。

本研究表明在缺氧環(huán)境中，隨著缺氧時間的延長，人乳腺癌MCF-7細胞的HIF-2α和多藥耐藥相關基因MDR1的蛋白和mRNA水平的表達量均逐漸增高，但二基因的表達在恢復供氧僅3 h后即開始下降。這些現(xiàn)象提示乳腺癌細胞高表達MDR1基因可受周圍環(huán)境缺氧的誘導，而MDR1的表達直接參與了乳腺癌多藥耐藥表型的形成已被證實，因而我們可得出結論：乳腺癌生長局部微環(huán)境的缺氧可誘導其MDR的產生，乳腺癌在其生長微環(huán)境因素的影響下，由于細胞內MDR相關基因的表達升高而獲得了MDR的表型。另外在本研究中多藥耐藥相關基因MDR1的表達增高與HIF-2α的表達亦呈同步性變化，這提示細胞內多藥耐藥相關基因表達受核轉錄因子HIF-2α的調控。以上結果表明，在缺氧環(huán)境中核轉錄因子HIF-2α可受缺氧這一物理因素的影響來調控MDR基因的表達，從而使乳腺癌表現(xiàn)出了化療耐藥的特性。Rognon等〔9〕已證實MDR1基因是缺氧反應性基因，在該基因啟動子上存在著缺氧反應原件(HRE)，進一步從基因水平上為此結論提供了確鑿的證據。

綜上，乳腺癌產生MDR的重要原因之一是受其生長的缺氧微環(huán)境所誘導。缺氧可通過核轉錄因子HIF-2α來調控乳腺癌細胞內MDR1基因的表達，從而使乳腺癌出現(xiàn)以基因水平改變?yōu)榛A的獲得性耐藥。同時這也提示HIF-2α和多藥耐藥基因將可能成為臨床上逆轉乳腺癌化療耐藥的新的分子靶點；設計可特異性阻斷其表達的小分子，并與化療藥物聯(lián)合應用，將有望成為實現(xiàn)乳腺癌有效化療的重要手段。

1 Hu Y,Wang J,Tao H,etal.Association analysis between MDR1 genetic variant and breast cancer risk factors in Chinese Han population〔J〕.Med Oncol,2013；30(3):683.

2 He C,Sun XP,Qiao H,etal.Downregulating hypoxia-inducible factor-2α improves the efficacy of doxorubicin in the treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Sci,2012；103(3):528-34.

3 Christiaansen CE,Sun Y,Hsu YC,etal.Alterations in expression of HIF-1α,HIF-2α,and VEGF by idiopathic overactive bladder urothelial cells during stretch suggest role for hypoxia〔J〕.Urology,2011；77(5):1266.e7-11.

4 Zhao D,Zhai B,He C,etal.Upregulation of HIF-2α induced by sorafenib contributes to the resistance by activating the TGF-α/EGFR pathway in hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Cell Signal,2014；26(5):1030-9.

5 Huang F,Wu XN,Chen J,etal.Resveratrol reverses multidrug resistance in human breast cancer doxorubicin-resistant cells〔J〕.Exp Ther Med,2014；7(6):1611-6.

6 Rundqvist H,Johnson RS.Tumour oxygenation:implications for breast cancer prognosis〔J〕.J Intern Med,2013；274(2):105-12.

7 吳 倩，袁 凱，錢 成，等.HIF-2α基因與人肺腺癌A549細胞株對順鉑耐藥性的關系〔J〕.中國臨床醫(yī)學,2013；20(6):772-5.

8 Chen J,Ding Z,Peng Y,etal.HIF-1α inhibition reverses multidrug resistance in colon cancer cells via downregulation of MDR1/P-Glycoprotein〔J〕.PLoS One,2014;9(6):e98882.

9 Rognon B,Kozovska Z,Coste AT,etal.Identification of promoter elements responsible for the regulation of MDR1 from Candida albicans,a major facilitator transporter involved in azole resistance〔J〕.Microbiology,2006;152(Pt 12):3701-22.

〔2016-04-01修回〕

(編輯 曹夢園)

河南省自然科學基金面上項目(162300410220)；河南省教育廳高等學校重點科研項目(16A310002)；河南省高校青年骨干教師資助項目(2012GGJS-136)；新鄉(xiāng)醫(yī)學院聯(lián)合培育基金資助項目(2014QN113)

李 娜(1977-)，女，博士，副教授，主要從事惡性腫瘤分子病理學研究。

R73-37

A

1005-9202(2017)11-2638-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.016