蔡 洲 戴宇翃

(武漢科技大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北 武漢 430083)

miRNA-425-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲過程的分子機(jī)制

蔡 洲 戴宇翃1

(武漢科技大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北 武漢 430083)

目的 探討microRNA-425-5p(miR-425-5p)對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法 將miR-425-5p及對照分別轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞系PANC-1進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗、Transwell遷移和Matrigel侵襲實(shí)驗，觀察miR-425-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。通過查閱文獻(xiàn)尋找可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移或侵襲過程的miR-425-5p的靶蛋白，然后將該蛋白過表達(dá)進(jìn)行上述功能學(xué)實(shí)驗。結(jié)果 CCK-8增殖實(shí)驗、Transwell遷移和Matrigel侵襲實(shí)驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，miR-425-5p能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。對過表達(dá)miR-425-5p的靶基因腦海綿狀血管瘤3(CCM3)進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CCM3抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)論 miR-425-5p可能通過靶向下調(diào)CCM3促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程。

miR-425-5p；腦海綿狀血管瘤3；增殖；遷移；侵襲

胰腺癌惡性程度非常高，早期癥狀不明顯，易發(fā)生轉(zhuǎn)移且對治療的反應(yīng)較差。許多患者在就診時腫瘤已處于進(jìn)展期或者發(fā)生轉(zhuǎn)移，且放療及化療對胰腺癌的治療效果不明顯，如吉西他濱，患者很容易對其發(fā)生耐藥反應(yīng)〔1〕。microRNAs(miRNAs)是一類進(jìn)化上高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，廣泛存在于多種細(xì)胞生物中，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控〔2〕。而在胰腺癌組織中許多miRNAs的表達(dá)水平發(fā)生改變，通過調(diào)節(jié)一些原癌基因或者抑癌基因的表達(dá)，參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程〔3〕。有研究報道m(xù)iR-425-5p在胃癌組織中高表達(dá)且參與胃癌的轉(zhuǎn)移過程〔4〕。此外，在宮頸癌組織中miR-425-5p也處于較高的表達(dá)水平〔5〕，且可靶向作用于腦海綿狀血管瘤3(CCM3)發(fā)揮生物學(xué)作用〔6〕。本文通過過表達(dá)miR-425-5p觀察該miRNA對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并觀察miR-425-5p的靶基因CCM3是否參與該過程。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 人胰腺癌細(xì)胞PANC-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，生長于含10%滅活胎牛血清(FBS)、2 mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogene公司。八肽膽囊收縮素(CCK-8)化學(xué)試劑購自日本同仁化學(xué)。Transwell小室(8 μm)購于Millipore 公司。基質(zhì)膠(BD MatrigelTMBasement Membrane Matrix)購自BD Biosciences公司。MiR-425-5p mimic和陰性對照(NC)由上海吉瑪生物公司合成。CCM3過表達(dá)質(zhì)粒及空載體對照質(zhì)粒購自北京義翹神州生物科技有限公司。為了驗證CCM3的作用，利用LipofectamineTM2000將CCM3過表達(dá)質(zhì)粒及空載體對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入過表達(dá)miR-425-5p和NC。

1.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測miR-425-5p的表達(dá)水平 實(shí)驗前1 d分別將miR-425-5p和NC根據(jù)LipofectamineTM2000說明書推薦的操作，轉(zhuǎn)染入PANC-1細(xì)胞，運(yùn)用RT-qPCR檢測miR-425-5p的表達(dá)水平。首先提取轉(zhuǎn)染后的PANC-1細(xì)胞RNA為模板，加入500 nmol/L相應(yīng) miRNA 逆轉(zhuǎn)錄引物(RT引物)4 μl配置成模板-引物混合液。將上述混合液置70℃水浴10 min，0℃冰浴2～3 min。同時配置以下反應(yīng)體系：2.5 mmol/L dNTP 4 μl，5×RT Buffer 10 μl，200 U/ml反轉(zhuǎn)錄酶1 μl，40 U/ml RNase inhibitor 1 μl。將冰浴后模板-引物混合液加入以上反應(yīng)體系中，以無核酸酶ddH2O補(bǔ)足至總體積為50 μl。42℃水浴90 min后，95℃ 5 min終止反轉(zhuǎn)錄，立即0℃冰浴5 min，即獲得cDNA。各引物序列見表1。該cDNA可用于相應(yīng)microRNA RT-qPCR檢測。95℃ 20 s預(yù)變性，按95℃ 10 s變性、60℃ 20 s退火、70℃ 10 s延伸過程循環(huán)40次，獲得Ct值。獲得的Ct值按Applied Biosystem公司ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2推薦方法進(jìn)行計算并比較各樣本中相應(yīng) miRNA的表達(dá)水平。

表1 microRNA RT-qPCR引物與PCR特異性引物

1.4 CCK-8增殖實(shí)驗 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，次日用胰酶消化細(xì)胞以3 000個/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，以空白孔調(diào)零，波長為450 nm下，用Bioteck DR-3506全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀測出每孔OD值。

1.5 Transwell 遷移實(shí)驗 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞第2天進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗。首先于24孔板中加入500 μl 10%FBS DMEM培養(yǎng)基，將 Transwell小室置于孔上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡30 min。然后將轉(zhuǎn)染有miR-425-5p和NC的細(xì)胞消化，用純DMEM培養(yǎng)基配制成5×105個/ml 的細(xì)胞懸液。每個小室加入200 μl細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個。每組設(shè)置3個復(fù)孔，將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別于培養(yǎng)6 h和12 h后取

出小室染色固定，應(yīng)用奧林巴斯顯微鏡進(jìn)行拍照計數(shù)，觀察進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量以判斷細(xì)胞遷移情況。

1.6 Matrigel侵襲實(shí)驗 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞第2天進(jìn)行Matrigel侵襲實(shí)驗。將基質(zhì)膠和DMEM培養(yǎng)基按2∶1配成基質(zhì)膠-DMEM 混合液，置于冰上備用。將Transwell 小室置于24孔板中，下室加入500 μl 10%FBS DMEM培養(yǎng)基，每個小室加入60 μl基質(zhì)膠-DMEM混合液，于 37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。然后將轉(zhuǎn)染有microRNA-425-5p和NC的細(xì)胞消化，用純DMEM培養(yǎng)基配制成5×105個/ml 的細(xì)胞懸液。每個小室加入200 μl細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別于6 h和12 h取出小室染色固定，顯微鏡下拍照計數(shù)，觀察進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量以判斷細(xì)胞侵襲情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件，兩組之間的比較行成組t檢驗，多組間行單因素方差分析、重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)miR-425-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖 與NC相比，轉(zhuǎn)染miR-425-5p組miR-425-5p的表達(dá)水平明顯上升(圖1A)。隨即利用細(xì)胞進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗。CCK-8增殖實(shí)驗結(jié)果顯示，在實(shí)驗第3、4、5天，過表達(dá)miR-425-5p后PANC-1細(xì)胞的增殖能力明顯高于對照組(P<0.05)(圖1B)。

2.2 過表達(dá)miR-425-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲 見圖2。與NC比較，轉(zhuǎn)染有miR-425-5p組細(xì)胞在6 h〔遷移細(xì)胞數(shù)：NC組(98±7)，miR-425-5p組(152±18)；侵襲細(xì)胞數(shù)：NC組(72±6),miR-425-5p組(115±9)〕或12 h〔遷移細(xì)胞數(shù)：NC組

1)P<0.05 圖1 過表達(dá)miR-425-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖

圖2 過表達(dá)microRNA-425-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

(195±17)，miR-425-5p組：(263±20)；侵襲細(xì)胞數(shù)NC組(138±7)，miR-425-5p組(285±15)〕遷移與侵襲到小室底部的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。

2.3 過表達(dá)CCM3抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖過程 miR-425-5p+對照組細(xì)胞增殖能力>NC+對照組，與圖1B結(jié)果一致，但當(dāng)過表達(dá)CCM3后，細(xì)胞的增殖能力與相應(yīng)的對照組相比均下降(P<0.05)。以上結(jié)果提示過表達(dá)CCM3后能明顯抑制PANC-1細(xì)胞的增殖能力，而miR-425-5p可以靶向下調(diào)CCM3的表達(dá)水平，因此推測miR-425-5p通過下調(diào)CCM3的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。見圖3。

2.4 過表達(dá)CCM3抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程 無論6 h還是12 h，miR-425-5p+對照組細(xì)胞遷移和侵襲能力>NC+對照組，與圖2一致；但當(dāng)過表達(dá)CCM3后，細(xì)胞的遷移與侵襲能力與相應(yīng)的對照組相比均下降。以上結(jié)果提示過表達(dá)CCM3能明顯抑制PANC-1細(xì)胞的遷移與侵襲能力(P<0.05)，而miR-425-5p可以靶向下調(diào)CCM3的表達(dá)水平。見表2。因此推測miR-425-5p通過下調(diào)CCM3的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。

1)P<0.05 圖3 過表達(dá)CCM3抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖過程

組別遷移細(xì)胞數(shù)6h12h侵襲細(xì)胞數(shù)6h12hNC+對照組86±20198±4275±15152±16NC+CCM3組64±91)124±251)41±71)95±131)miR-425-5p+對照組130±191)2)268±361)2)110±161)2)286±271)2)miR-425-5p+CCM3組90±72)3)189±142)3)99±71)2)126±121)2)3)單因素方差分析 F值20.42521.29339.185128.842 P值0.0000.0000.0000.000

與NC+對照組比較：1)P<0.05；與NC+CCM3組比較：2)P<0.05；與miR-425-5p+對照組比較：3)P<0.05

3 討 論

胰腺癌較高的死亡率與其易發(fā)生轉(zhuǎn)移密不可分，約80%的患者在確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔7〕。因此，關(guān)于胰腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的探索對發(fā)現(xiàn)新的診斷及治療方案確有必要。許多miRNAs被發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織及癌旁組織中呈現(xiàn)差異性表達(dá)。例如，低表達(dá)的miR-96可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和腫瘤生長〔8〕；而高表達(dá)的miR-10a可以誘導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移〔9〕。因此，關(guān)于關(guān)鍵性miRNAs的研究發(fā)現(xiàn)可作為胰腺癌的診斷及新型治療方案提出的理論基礎(chǔ)〔10〕。本文研究發(fā)現(xiàn)miR-425-5p可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，且先前研究發(fā)現(xiàn)miR-425-5p可靶向下調(diào)CCM3，過表達(dá)CCM3再次進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CCM3后胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲過程明顯受到抑制。本研究得出miR-425-5p同樣通過抑制CCM3的表達(dá)參與胰腺癌的腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程。CCM3又名程序性細(xì)胞死亡10(PDCD10)，該基因主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)〔11〕。miR-425-5p通過下調(diào)其表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖過程。此外，CCM3還參與調(diào)節(jié)許多蛋白激酶的激活，比如可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路〔12〕。本研究推測miR-425-5p通過CCM3間接調(diào)節(jié)蛋白激酶的改變從而調(diào)控一系列信號分子或者基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員的表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移過程，但仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。綜上所述，miR-425-5p通過靶向下調(diào)CCM3促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，這是首次關(guān)于miR-425-5p在胰腺癌中的報道。該結(jié)果提示靶向抑制miR-425-5p有可能成為阻止胰腺癌腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的潛在治療方案。

1 文娣娣，張振華，任 靜，等.胰腺癌發(fā)病的分子機(jī)制和診斷〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015；15(27)：5384-7.

2 李衍訓(xùn).microRNA：胰腺癌早期診斷的潛在標(biāo)記物〔J〕.中國普通外科雜志，2014；23(3)：367-71.

3 Li Y，Sarkar FH.MicroRNA targeted therapeutic approach for pancreatic cancer〔J〕.Int J Biol Sci，2016；12(3)：326-37.

4 Zhang Z，Li Y，F(xiàn)an L，etal.MicroRNA-425-5p is upregulated in human gastric cancer and contributes to invasion and metastasis in vitro and in vivo〔J〕.Exp Ther Med，2015；9(5)：1617-22.

5 Zhang Y，Hu X，Miao X，etal.MicroRNA-425-5p regulates chemoresistance in colorectal cancer cells via regulation of programmed cell death 10〔J〕.J Cell Mol Med，2016；20(2)：360-9.

6 Lerch MM，Mayerle J，Mahajan U，etal.Development of pancreatic cancer：targets for early detection and treatment〔J〕.Dig Dis，2016；34(5)：525-31.

7 Dart A.Metastasis：CXCR2-targeted therapy for pancreatic cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2016；16(7)：411.

8 Huang X，Lv W，Zhang JH，etal.miR96 functions as a tumor suppressor gene by targeting NUAK1 in pancreatic cancer〔J〕.Int J Mol Med，2014；34(6)：1599-605.

9 Ohuchida K，Mizumoto K，Lin C，etal.MicroRNA-10a is overexpressed in human pancreatic cancer and involved in its invasiveness partially via suppression of the HOXA1 gene〔J〕.Ann Surg Oncol，2012；19(7)：2394-402.

10 Lin SZ，Xu JB，Ji X，etal.Emodin inhibits angiogenesis in pancreatic cancer by regulating the transforming growth factor-β/drosophila mothers against decapentaplegic pathway and angiogenesis-associated microRNAs〔J〕.Mol Med Rep，2015；12(4)：5865-71.

11 Stamatovic SM，Sladojevic N，Keep RF，etal.PDCD10 (CCM3) regulates brain endothelial barrier integrity in cerebral cavernous malformation type 3：role of CCM3-ERK1/2-cortactin cross-talk〔J〕.Acta Neuropathol，2015；130(5)：731-50.

12 Zhu Y，Zhao K，Prinz A，etal.Loss of endothelial programmed cell death 10 activates glioblastoma cells and promotes tumor growth〔J〕.Neurol Oncol，2016；18(4)：538-48.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

蔡 洲(1977-)，男，碩士，講師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

R34

A

1005-9202(2017)11-2629-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.012

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科