熊 斌

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院新區(qū)，四川 南充 637000)

甲狀腺癌中生物標志的篩選及基于生物學信息的驗證

熊 斌

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院新區(qū)，四川 南充 637000)

目的 探討甲狀腺癌中生物標志的篩選方法及基于生物學信息的驗證效果。方法 甲狀腺癌患者189例為觀察組；取同期入院健康體檢者189例為對照組。采用生物信息學預測靶基因的方法完成生物標志的篩選，采集兩組外周血，采用受試者工作特征曲線(ROC)對差異性基因進行驗證。結(jié)果 觀察組差異表達miRNA基因中AXIN2、 ITGA3表達水平顯著低于對照組，TP53INP1、TP53INP2顯著高于對照組(均P<0.05)； 差異基因AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3診斷敏感性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AXIN2、TP53INP1、TP53INP2診斷特異性高于ITGA3(P<0.05)。結(jié)論 甲狀腺癌患者外周血中AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3表達存在明顯的差異，且均經(jīng)過生物學信息得到驗證，AXIN2、TP53INP1和TP53INP2能提高甲狀腺乳頭狀癌的診斷準確率。

甲狀腺癌；生物標志；生物學信息

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占全部甲狀腺癌的80.0%，患者發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診已經(jīng)是中、晚期，從而錯過了最佳治療時機〔1〕。目前臨床上對于甲狀腺癌診斷方法相對較多，如血清甲狀腺激素測定、超聲診斷檢查等〔2〕。但是臨床診斷時10.0%患者難以最終確診。完整的生物學信息主要包括3個部分：①根據(jù)存在的問題建立更具針對性的信息數(shù)據(jù)庫；②利用計算機等多種方法開發(fā)、挖掘生物學數(shù)據(jù)，從而研制出數(shù)據(jù)的算法；③利用各種工具完成不同類型生物學數(shù)據(jù)的處理和分析。此外，生物信息學中包括了基因功能的預測假說，能為生物學的實驗設計提供思路和方法〔3〕。由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多基因參與的過程，在其發(fā)生、發(fā)展過程中癌細胞能分泌、合成各種物質(zhì)到體液中，臨床將其稱為腫瘤標志物(TM)，這些物質(zhì)具有篩查功能、診斷功能、判斷預后及監(jiān)測療效的功能。目前臨床上常用的TM篩查方法包括〔4〕腫瘤細胞株、腫瘤組織及腫瘤患者血液、分泌物等，常用方法主要有全基因組芯片掃描、蛋白差異表達等，不同的篩查方法各有優(yōu)缺點，且臨床缺乏統(tǒng)一的標準。針對上述研究中存在的問題及不足，本實驗采用生物信息學預測靶基因的方法完成生物標志的篩選，并基于生物學信息完成對生物標志的驗證。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年7月至2016年8月南充市州北醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的甲狀腺癌患者189例為觀察組，男98例，女91例，年齡40～85〔平均(64.9±2.9)〕歲。納入標準：①符合甲狀腺癌臨床診斷標準；②經(jīng)過影像、生化指標檢查及手術(shù)病理最終確診。取同期入院健康體檢者189例為對照組，男93例，女96例，年齡41～84〔平均(63.1±2.8)〕歲。排除標準：①合并有影響效應指標觀測、判斷的其他生理或病理狀況者；②合并嚴重心、肝、腎功能異常者；③合并傳染性疾病及意識不清或存在精神障礙者。

1.2 主要儀器及試劑 實時定量PCR試劑盒(大連 Takara)，miRNA芯片及全基因組微珠芯片(美國 Illumina)，紅細胞裂解液(北京 Aidlab)，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，無菌超凈工作臺(江蘇凈化設備廠)，移液器吸頭(江蘇海門)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 BioRad)。

1.3 方法

1.3.1 生物標志的篩選

1.3.1.1 miRNA靶基因預測 miRNA和靶基因之間的相互作用具有一定的規(guī)律性，可以采用編程的方法進行預測，采用軟件根據(jù)種子區(qū)原則將miRNA 5′端第2～8位堿基與miRNA 3′UTR的一段序列完成配對。見圖1。

由于不同的網(wǎng)站容納的miRNA及靶基因數(shù)據(jù)庫不同，為了進一步提高靶基因的篩選準確率，選擇4個及以上網(wǎng)站完成生物標志的篩選〔5〕。

1.3.1.2 TCGA數(shù)據(jù) TCGA是美國國家腫瘤中心發(fā)起的，共收錄了20種腫瘤類型，而對于甲狀腺患者共收集并公開507例，包括493個外顯子、507例單核苷酸多態(tài)性、505例表達譜mRNA及505例臨床資料。在圖2界面下選擇RNASeqV2、miRNASeq 和 Clinical等按鈕，輸入郵箱地址，申請TCGA數(shù)據(jù)連接，并完成數(shù)據(jù)的下載。見圖2〔6〕。

1.3.1.3 生物標志的篩選 對入選的189例甲狀腺癌患者組織的數(shù)據(jù)庫進行整理，為了進一步提高檢出效率，剔除檢測過程中出現(xiàn)某檢出信號值為0時的數(shù)據(jù)和平均信號強度<100的數(shù)據(jù)。最終將癌平均信號/正常信號值>1.99或<0.509的數(shù)據(jù)進行后續(xù)處理分析。對499例差異表達的miRNA進行腫瘤信號值/正常信號值的計算，對于高表達或低表達占整體85.0%的miRNA納入后續(xù)分析。利用5個預測靶基因軟件完成基因的預測〔7〕。將預測出的靶基因與表達譜芯片數(shù)據(jù)庫進行對比，參考miRNA負向調(diào)控靶基因原理，將上調(diào)的預測靶基因與下調(diào)的差異miRNA，下調(diào)的預測靶基因與上調(diào)的miRNA進行匯總，并作為差異miRNA在甲狀腺癌中調(diào)控的預測靶基因，完成腫瘤信號值/正常信號值的計算，對于計算數(shù)據(jù)高表達或低表達占整體85%的基因進行篩選，提取基因芯片未出現(xiàn)或不符合要求的靶基因，最終獲得差異生物標志〔8〕。

1.3.2 ROC曲線對差異性基因進行驗證 (1)數(shù)據(jù)庫的建立。將TCGA甲狀腺mRNA數(shù)據(jù)中505個樣本芯片數(shù)據(jù)匯總到數(shù)據(jù)庫中，建立數(shù)據(jù)庫，見圖3。將TCGA甲狀腺癌mRNA數(shù)據(jù)中506個樣本的mRNA芯片數(shù)據(jù)匯總到數(shù)據(jù)庫中，建立數(shù)據(jù)庫，

見圖4。將TCGA甲狀腺癌mRNA數(shù)據(jù)中505個樣本中匯總到一個數(shù)據(jù)庫中，建立數(shù)據(jù)庫。見圖5。

圖1 miRNA靶基因預測

圖2 甲狀腺TCGA數(shù)據(jù)獲取申請

圖3 建立芯片數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫

圖4 建立TCGA甲狀腺癌mRNA數(shù)據(jù)庫

圖5 建立TCGA甲狀腺癌臨床資料數(shù)據(jù)庫

將試驗中選擇的甲狀腺癌患者189例和健康對照組189例基本信息錄入其中，入院后第2天空腹抽取4 ml靜脈血，采用血清分離管離心后在冰上進行30 min凝結(jié)，2 000 r/min，離心10 min，取上層清夜，以200 μl分裝入1.5 ml EP管中，通過測定生物指標的敏感度和特異性繪制ROC曲線，通過計算曲線下面積，判斷其靈敏度和特異度〔9〕。

1.4 診斷標準誤評價指標 通過受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)進行甲狀腺癌診斷。對于AUC總分1分者，得分越高，判斷準確性越高〔10〕。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 兩組AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3等差異基因的表達 觀察組差異表達miRNA基因中AXIN2、 ITGA3表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；TP53INP1、TP53INP2顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2 AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3診斷敏感性、特異性比較 AXIN2，TP53INP1，TP53INP2 和 ITGA3診斷敏感性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AXIN2，TP53INP1，TP53INP2診斷特異性高于ITGA3(P<0.05)。見表2和圖6。

表1 兩組基因AXIN2，TP53INP1，TP53INP2和 ITGA3的差異表達

表2 AXIN2，TP53INP1，TP53INP2 和 ITGA3診斷敏感性、 特異性比較

圖6 AXIN2，TP53INP1，TP53INP2 和 ITGA3的ROC比較

3 討 論

甲狀腺癌已經(jīng)位于女性惡性腫瘤的第5位，常見的甲狀腺癌主要包括乳頭狀癌(占90.0%)、濾泡癌及甲狀腺髓樣癌(3%～12%)等，發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診已經(jīng)是中、晚期，錯過了最佳治療時機。臨床上對于甲狀腺癌的診斷以觸診、彩色超聲、同位素顯像及穿刺活檢檢查為主，其中穿刺活檢最準確，但具有創(chuàng)傷性，難以滿足臨床診斷需要〔11〕。基因芯片技術(shù)是將一段由寡聚核苷酸或cDNA構(gòu)成的脫氧核苷酸序列進行固定，待測樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄合成新的cDNA后，染色并與之進行基因序列的分子雜交，使得待測樣本的cDNA與片段基因上的DNA進行有效的結(jié)合。通過比較待測序列與非患病序列之間的差異，能為疾病的診斷、治療等提供依據(jù)和參考。而在基因芯片技術(shù)中生物信息學發(fā)揮了重要的作用，利用生物信息學能利用虛擬計算機技術(shù)等作為工具，分析出相對重要的規(guī)律性信息。研究甲狀腺差異基因時首先考慮樣本量的大小，由于患者之間存在明顯的個體差異，單個基因芯片的檢測并不能準確反映該類疾病的一般規(guī)律〔9〕。本實驗為了獲得多重生物信息，通過以下方法完成生物標志的篩選：(1)數(shù)據(jù)整理；(2)與試驗中建立的數(shù)據(jù)進行比較；(3)采用靶基因預測網(wǎng)站完成基因的預測。本研究表明甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多基因過程，且在腫瘤的診斷中AXIN2能發(fā)揮重要的作用。AXIN2屬于wnt通路中相對比較重要的穩(wěn)定因子，能使β-連環(huán)蛋白降解，其低表達是惡性腫瘤發(fā)生中相對比較重要的因素。同時，AXIN2主要定位在常染色體中，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮了重要的作用，而在乳腺癌和神經(jīng)母細胞瘤等惡性腫瘤中能發(fā)揮抑癌作用。在甲狀腺癌患者中，由于AXIN2蛋白水平相對較低，使得其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，并且AXIN2水平的高低還與病灶的數(shù)量、甲狀腺浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤瘤體大小等關(guān)系密切。TP53INP1、TP53INP2在是否存在殘余腫瘤患者中表達存在差異。TP53INP1，TP53INP2水平相對較高的患者，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，臨床應該立即采取有效的措施進行干預治療。臨床上甲狀腺癌患者診斷時應該加強AXIN2，TP53INP1、TP53INP2基因的監(jiān)測，發(fā)揮不同指標優(yōu)勢，為臨床治療提供依據(jù)和參考〔12〕。

1 Weissel，M.Legal augmentation of iodine content in table salt from 10 to 20 mg KI/kg:documented effects a decade later〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes,2013;111(4):187-90.

2 王金行，周雯雯，程仕彤，等.miRNA-21慢病毒表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U266細胞系〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2014;22(4):776-9.

3 龍衛(wèi)國，鄭 芳，丁 偉,等.miRNA-21抑制劑在5-FU抑制腸癌細胞増殖中的作用〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2014;30(2):131-4.

4 李 覃，王 偉，張 實,等.白黎蘆醇調(diào)節(jié)STAT3與miRNA-21表達抗肝癌作用的初步研究〔J〕.中國藥理學通報，2014;30(2):186-91.

5 Caini S，Gibelli B，Palli D，etal.Menstrual and reproductive history and use of exogenous sex hormones and risk of thyroid cancer among women:a meta-analysis of prospective studies〔J〕.Cancer Causes Control，2015;26 (4):511-8.

6 胡欣春，魏益平，喻東亮,等.miRNA-21抑制物對A549細胞球増殖的影響及機制〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(9):2456-9.

7 蘇力夫，張生彬，朱永蒙.納米碳示蹤前哨淋巴結(jié)在cN0 甲狀腺乳頭狀癌中的應用〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013;23(7):110-2.

8 Han JM，Kim TY，Jeon MJ，etal.Obesity is a risk factor for thyroid cancer in a large，ultrasonographically screened population〔J〕. Eur J Endocrinol，2013;168(6):879-86.

9 賀夢子，趙銀龍，劉曉冬，等.甲狀腺乳頭狀癌組織中差異表達miRNA及其靶基因的篩選和預測〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版)，2013;39(1)：99-103.

10 楊志芳，岳瑞雪，朱 智，等.納米碳在cN0期甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃手術(shù)中的應用〔J〕.中國普外基礎與臨床雜志，2013;20(9):976-80.

11 張美峰，吳克瑾，陳大偉，等.MiR-51在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其臨床診斷價值〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2015;23(14)：1971-4.

12 姚廷敬，彭德峰，朱金海，等.甲狀腺癌miRNA-146與BRAF突變的相關(guān)性研究〔J〕.淮海醫(yī)藥，2013;31(3):189-90.

〔2016-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

四川省衛(wèi)生計劃項目(No.2015-0122)

熊 斌(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事甲狀腺乳腺外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2617-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.007