龔美蓉 陳鳳麗 曹 晨 孫亦農(nóng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

腺苷酸激活蛋白激酶與肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的關(guān)系

龔美蓉 陳鳳麗 曹 晨 孫亦農(nóng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

目的 探討肥胖大鼠肝臟組織腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)的表達(dá)及其對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積的影響。方法 選用18只剛斷乳的SPF級(jí)SD雄性大鼠，隨機(jī)挑選6只普通飼料喂養(yǎng)為正常組，另一組12只高脂飼料喂養(yǎng)，12 w后成功建立肥胖模型大鼠6只。分別檢測(cè)體重、Lee指數(shù)、內(nèi)臟脂肪、肝濕重等指標(biāo)。通過油紅O染色和檢測(cè)肝臟甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量評(píng)估兩組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的情況。采用Western印跡檢測(cè)大鼠肝臟磷酸化(p)-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC水平。結(jié)果 與正常組大鼠相比，肥胖組大鼠體重與Lee指數(shù)、附睪脂肪、腎周脂肪量、肝濕重、肝臟內(nèi)TG與TC含量均顯著升高，油紅O染色結(jié)果顯示肥胖組肝臟脂質(zhì)沉積較正常組明顯增多。Western印跡結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，肥胖組大鼠肝臟p-AMPK/AMPK和p-ACC/ACC表達(dá)明顯降低。兩組大鼠肝臟組織中p-AMPK、p-ACC表達(dá)水平與肝臟TG、TC呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 高脂飲食誘導(dǎo)食源性肥胖大鼠可降低AMPK的活性，從而導(dǎo)致肝臟組織TG、TC合成增加，脂質(zhì)在肝臟組織中沉積增加。

腺苷酸激活蛋白激酶；脂質(zhì)沉積

中老年人的肥胖發(fā)病率隨著年齡的增長而明顯升高。肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官，肥胖患者易出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)異位沉積，從而導(dǎo)致肝臟脂代謝紊亂〔1〕。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在機(jī)體中廣泛存在。AMPK是調(diào)節(jié)脂代謝的重要靶點(diǎn)，也成為防治肥胖的一個(gè)新靶點(diǎn)〔2〕。本研究觀察高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠肝臟中AMPK活性及脂質(zhì)沉積相關(guān)指標(biāo)的變化，并探討二者之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用18只剛斷乳的SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重約70 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)。

1.2 儀器與試劑 高速低溫離心機(jī)、核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf公司)，酶標(biāo)儀(Biotek公司)，冰凍切片機(jī)(Leica公司)，垂直電泳槽與濕轉(zhuǎn)儀(Bio-RAD公司)，甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒(南京建成)，油紅O染料(Sigma)，一抗〔磷酸化(p)-AMPK/AMPK，p-ACC/ACC；cell signaling〕，二抗(cell signaling)。

1.3 肥胖大鼠模型的建立 參照孫志等〔3〕提供的實(shí)驗(yàn)性肥胖造模方法，將所有大鼠予以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)挑選6只，用普通飼料喂養(yǎng)，納入正常組；另一組12只，用蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司提供的高脂飼料喂養(yǎng)12 w，將體重超過普食組20%的大鼠定為肥胖大鼠模型，成功建立肥胖模型6只，納入肥胖組。大鼠自由攝食飲水，每周稱重一次。

1.4 標(biāo)本采集 12 w喂養(yǎng)結(jié)束后，禁食過夜，處死大鼠，分離并秤取附睪脂肪、腎周脂肪、肝臟質(zhì)量。肝臟組織迅速置于液氮中冷凍后，-80℃保存待測(cè)。

1.5 氯仿-甲醇法測(cè)定肝臟中TG、TC 取肝臟組織100 mg置于勻漿器中，加入緩沖液1 ml(氯仿∶甲醇=2∶1)勻漿，充分后將勻漿液放到2 ml EP管中室溫過夜。再加入0.6%NaCl混勻后常溫離心2 000 r/min、10 min，分層為水相和有機(jī)相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入250 μl乙醇溶解。根據(jù)相應(yīng)試劑盒指導(dǎo)操作，測(cè)定肝臟組織中TG、TC含量。

1.6 油紅O染色 制作大鼠肝臟組織冰凍切片，厚約30 μm，室溫干燥30～60 min，將切片浸入60%異丙醇中5 min后，油紅O染色10 min，置于60℃烘箱中。60%異丙醇中漂洗50 s，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。蘇木素染色3 min，自來水漂洗3 min，觀察到返藍(lán)即可取出。置于雙氧水(ddH2O)中甘油封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 Western印跡檢測(cè)蛋白水平 稱取肝臟組織100 mg，加入1 ml RIPA試劑(裂解液，PMSF，磷酸酶抑制劑)，置于冰上進(jìn)行勻漿，組織細(xì)胞充分裂解后，4℃離心，12 000 r/min、30 min，取上清并分裝為500 μl，保持于-80℃冰箱中。用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定上清液中蛋白含量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗：p-AMPK/AMPK(1∶1 000)、抗p-ACC/ACC (1∶1 000)4℃過夜，PBST洗膜3次，封閉1 h；PBST洗膜3次，二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h；PBST洗膜3次，用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)試劑盒進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。用Adobe Photoshop CS5圖像分析軟件測(cè)定目的蛋白條帶與對(duì)照蛋白條帶的面積與灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠體重、體長、Lee指數(shù)的比較 高脂喂養(yǎng)結(jié)束時(shí)，與正常組相比，肥胖組的體重與Lee指數(shù)顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.2 兩組大鼠不同部位脂肪量與肝濕重的比較 肥胖組大鼠附睪脂肪、腎周脂肪量明顯高于正常組大鼠(P<0.01)。與正常組相比，肥胖組的肝濕重顯著升高(P<0.01)。肝臟指數(shù)兩組大鼠之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 兩組大鼠體重、體長、Lee指數(shù)的比較

與正常組比較：1)P<0.01；下表同

表2 兩組大鼠脂肪量及肝濕重的比較±s,n=6)

2.3 兩組大鼠肝臟脂質(zhì)含量的比較 與正常組相比，肥胖組肝臟內(nèi)TG與TC的含量顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 兩組大鼠肝臟脂質(zhì)含量的比較

2.4 兩組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的比較 與正常組相比，肥胖組大鼠肝臟脂滴明顯增多，可以清晰地看到細(xì)胞質(zhì)中脂滴被油紅O染成紅色，分布在細(xì)胞質(zhì)中，表明肝臟細(xì)胞中出現(xiàn)脂質(zhì)沉積。見圖1。

圖1 兩組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積(×40，油紅O)

2.5 兩組大鼠肝臟組織AMPK活性比較 與正常組(設(shè)為1)相比，肥胖組肝臟中p-AMPK/AMPK水平(0.52±0.05)顯著下降(P<0.01)。見圖2。

2.6 兩組大鼠肝臟組織ACC的活性比較 與正常組(設(shè)為1)相比，肥胖組肝臟中p-ACC/ACC水平(0.67±0.01)顯著下降(P<0.01)。見圖3。

圖2 兩組大鼠肝臟AMPK磷酸化水平比較

圖3 兩組大鼠肝臟ACC磷酸化水平的比較

2.7 AMPK活性與肝臟脂質(zhì)指標(biāo)、p-ACC的相關(guān)性分析 兩組大鼠肝臟組織中p-AMPK與肝臟TG、TCL呈負(fù)相關(guān)(r=-0.6，P<0.01;r=-0.34，P<0.05)，與p-ACC呈正相關(guān)(r=0.982，P<0.01)。p-ACC與肝臟TG、TC呈負(fù)相關(guān)(r=-0.6，P<0.01;r=-0.602，P<0.01)。

3 討 論

肥胖時(shí)機(jī)體能量代謝與能量調(diào)控出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪堆積過多或分布異?！?〕；其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及的因素包括遺傳、精神、內(nèi)分泌、環(huán)境等〔5〕。AMPK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在真核細(xì)胞廣泛存在〔6〕，因其被AMP/ATP比值調(diào)控，準(zhǔn)確地開啟ATP分解、關(guān)閉ATP合成，因此被比喻為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”〔7〕。肝臟中AMPK被激活可抑制脂肪酸的合成，促進(jìn)脂肪酸的氧化分解；反之，AMPK去磷酸化失去活性，機(jī)體脂質(zhì)合成增加。當(dāng)AMP /ATP 比值增加(如細(xì)胞缺氧、饑餓、運(yùn)動(dòng)等因素的影響)，AMPK因其172 位Thr 磷酸化而被激活〔8〕。

肥胖病與能量代謝的平衡失調(diào)密切相關(guān)。Wang等〔9〕發(fā)現(xiàn)，ob/ob小鼠心肌p-AMPK水平明顯下降，當(dāng)使用藥物之后，心肌中p-AMPK水平上升，可改善異位脂質(zhì)沉積。高脂飲食可以誘導(dǎo)肥胖癥、胰島素抵抗等疾病的發(fā)生〔10〕。本研究結(jié)果提示肥胖大鼠出現(xiàn)明顯的脂代謝紊亂，肥胖大鼠肝臟中明顯出現(xiàn)了脂質(zhì)沉積。此外，肥胖組大鼠肝臟組織中p-AMPK表達(dá)顯著降低，提示長期高脂飲食降低了大鼠肝臟組織中的AMPK活性。同時(shí)觀察到肥胖組大鼠p-ACC表達(dá)顯著降低，ACC的催化活性增加，促進(jìn)脂肪酸的合成。

有研究表明ACC是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，是AMPK的重要底物，激活的AMPK可使ACC的79位蘇氨酸磷酸化，抑制ACC的催化活性，從而降低丙二酰輔酶A 的濃度進(jìn)而抑制脂肪酸的合成〔11〕。推測(cè)高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠p-AMPK表達(dá)下降，從而引起AMPK活性降低，使得p-ACC表達(dá)下降，ACC的催化活性增加一方面促進(jìn)了脂肪酸的合成作用〔12〕，另一方面在ACC作用下合成的丙二酰輔酶A增加，可抑制線粒體中CPT-1 的活性，使進(jìn)入線粒體中進(jìn)行β氧化的長鏈乙酰輔酶A含量降低，抑制脂肪酸氧化，促使大鼠肝臟脂質(zhì)沉積增加，形成肥胖〔13〕。肝臟細(xì)胞中TG與TCL含量增加，會(huì)引起肝臟細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性與反應(yīng)性降低，容易引發(fā)2型糖尿病〔14〕。

綜上所述，AMPK是調(diào)節(jié)脂代謝的重要靶點(diǎn)，也成為防治肥胖的一個(gè)新靶點(diǎn)。研究開發(fā)AMPK激動(dòng)劑、激活A(yù)MPK活性，將會(huì)是一個(gè)有效的防治肥胖的治療方案。

1 任 華，衣雪潔.長期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠肝臟LKB1-AMPK-ACC信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響〔J〕.沈陽體育學(xué)院學(xué)報(bào),2015;4:92-7.

2 Imai K,Inukai K,Ikegami Y,etal.LKB1,an upstream AMPK kinase,regulates glucose and lipid metabolism in cultured liver and muscle cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006;351(3):595-601.

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5 Morton GJ,Cummings DE,Baskin DG,etal.Central nervous system control of food intake and body weight〔J〕.Nature,2006;443(7109):289-95.

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10 肖海濤，裴曉萌,李 顯,等.高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖傾向和肥胖抵抗傾向大鼠內(nèi)臟脂肪visfatin和AMPK表達(dá)及其相互關(guān)系〔J〕.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2008;27(2):170-3.

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〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Expression of AMP-activated protein kinase in the liver and the relationship with lipid deposition

GONG Mei-Rong, CHEN Feng-Li, CAO Chen,etal.

The Second Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To explore the expressions of AMP-activated protein kinase in the liver and the relationship with lipid deposition.Methods 18 SPF SD male rats were chosen and then randomly divided into normal (n=6) and high-fat groups (n=12). After successful modeling, 6 rats were in obese group (n=6). Rat weight, visceral fat and liver weight were compared. Lipid deposition was evaluated by oil red O dye and total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were measured. The expression of AMP activated protein kinase (AMPK) and acetyl-CoA carboxylase (ACC) in the liver were measured by Western blot.Results Compared with those of normal group, body weight, epididymal fat, perirenal fat, liver weight, TG and TC levels in the liver of obese group were significantly increased . The lipid deposition in the liver of obese rat was significantly increased compared with that of normal group. The phosphorylation AMPK (pAMPK) and ACC (pACC) were decreased in the liver of the obese group. The expression of pAMPK and pACC were negatively correlated with TG and TC level in the liver.Conclusions High-fat diet could induce obese, and then reduce AMPK activity, increase TG and TC level in the liver and result in lipid deposition in the liver.

AMPK; Obese rat; Lipid deposition

國家自然科學(xué)基金 (81202742，81403481，81403114)

龔美蓉(1973-)，女，博士，助理研究員，主要從事針刺減肥理論及實(shí)驗(yàn)研究。

R589.2

A

1005-9202(2017)11-2603-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.002