陳 飛， 喬 祺， 王張生， 許 澎， 陸 剛

1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200240 2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院急診科，上海 200240

·論 著·

丹參酮ⅡA磺酸鈉在缺血性斑馬魚(yú)模型中的促血管新生作用

陳 飛1， 喬 祺1， 王張生1， 許 澎1， 陸 剛2*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200240 2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院急診科，上海 200240

目的： 觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉 (Tan ⅡA)對(duì)缺血性斑馬魚(yú)模型的促血管新生作用及其潛在機(jī)制。方法： 用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRKI)誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚(yú)模型，分別予以50、100、200 μmol/L的Tan ⅡA處理。觀察Tan ⅡA在上述濃度下對(duì)缺血性斑馬魚(yú)腸下靜脈血管(SIVs)和節(jié)間血管(ISVs)的影響，并利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)flt-1、flk-1A (kdrl)、flk-1B(kdr)3個(gè)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化。 結(jié)果： 在VRKI誘導(dǎo)的血管損傷斑馬魚(yú)模型中，Tan ⅡA呈濃度依賴性地逐漸恢復(fù)ISVs和SIVs血管；通過(guò)VEGF通路上的相關(guān)基因[flt-1、flk-1A (kdrl)、flk-1B(kdr)]進(jìn)行調(diào)控。 結(jié)論： 在缺血性斑馬魚(yú)模型中，Tan ⅡA可通過(guò)VEGF信號(hào)通路發(fā)揮其促血管新生和保護(hù)血管作用。

丹參酮ⅡA磺酸鈉; 血管新生; 斑馬魚(yú); 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰等功效。丹參是復(fù)方丹參滴丸(已通過(guò)全球9個(gè)國(guó)家127個(gè)臨床中心的Ⅲ期臨床試驗(yàn)并得到FDA認(rèn)可)的主要成分，其諸多單體和復(fù)方制劑廣泛應(yīng)用于冠心病、缺血性卒中等疾病。其中丹參酮ⅡA是丹參的主要活性成分(脂溶性)，經(jīng)過(guò)能夠提高水溶性的磺酸化結(jié)構(gòu)修飾之后[1]，成為丹參酮ⅡA磺酸鈉(Tan ⅡA)。Tan ⅡA在臨床上已廣泛應(yīng)用于冠心病、心絞痛、心肌梗死，近年來(lái)也用于室性早搏。研究[2-5]證實(shí)，Tan ⅡA具有血管新生雙向調(diào)節(jié)機(jī)制，其可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖和血管擬態(tài)形成，進(jìn)而抑制腫瘤血管新生；另一方面其具有促血管新生作用。

斑馬魚(yú)普遍用于多種藥物的篩選中[6]。研究[7]表明，斑馬魚(yú)血管系統(tǒng)及其對(duì)調(diào)節(jié)血管新生的藥物治療反應(yīng)與哺乳動(dòng)物類似。雖然Tan ⅡA已用于多種細(xì)胞和動(dòng)物模型，但其在缺血性模型中的應(yīng)用較少。因此，本研究應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(vascular endothelial growth factor receptor kinase inhibitor Ⅱ, VRKI)誘導(dǎo)血管損傷轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(fli1α∶EGFP)y1模型，觀察了Tan ⅡA對(duì)此模型血管新生的作用，并初步探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(fli1α∶EGFP)y1由中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所斑馬魚(yú)技術(shù)平臺(tái)提供。

1.2 藥物、試劑與儀器 Tan ⅡA購(gòu)于上海永恒生物科技有限公司，溶解于DMSO中配制為50 mmol/L的儲(chǔ)備液。 VRKI購(gòu)于美國(guó)Calbiochem公司(Cat. No. 676481)，溶解在DMSO中配制為500 μg/mL的儲(chǔ)備液，-20℃儲(chǔ)存。紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV 8453 Agilent Technologies)、奧林巴斯旋轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 健康轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型實(shí)驗(yàn) 選擇狀態(tài)良好，發(fā)育至24 h的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(fli1α∶EGFP)y1胚胎，除去卵殼，將其放入含有飼養(yǎng)液(0.2%DMSO)的24孔板中(每孔不少于15個(gè))。Tan ⅡA組分別為50、100、200 μmol/L的Tan ⅡA， 對(duì)照組僅以0.2%DMSO為飼養(yǎng)液。兩組均放入28.5℃的飼養(yǎng)箱里飼養(yǎng)。48 hpf(hours post fertilization)時(shí)，清洗24孔板上的加藥孔，重新加入飼養(yǎng)液和不同濃度的Tan ⅡA。72 hpf時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)腸下靜脈血管(subintestinal veins, SIVs)及節(jié)間血管(intersegmental vessels, ISVs)的狀態(tài)。

1.4 VRKI誘導(dǎo)血管損傷轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型實(shí)驗(yàn) 選擇狀態(tài)良好，發(fā)育至21 h的斑馬魚(yú)胚胎，除去卵殼，將其放入含飼養(yǎng)液(0.2%DMSO)的24孔板中(每孔不少于15個(gè))。對(duì)照組僅以飼養(yǎng)液培養(yǎng)；VRKI組預(yù)先在飼養(yǎng)液中加入VRKI 500 ng/mL，在飼養(yǎng)箱里處理3 h后，以0.2%DMSO清洗3～4遍，繼續(xù)以0.2%DMSO培養(yǎng)；Tan ⅡA組分別為50、100、200 μmol/L的Tan ⅡA，在飼養(yǎng)箱里處理3 h，以0.2%DMSO清洗3～4遍后，再加入不同濃度Tan ⅡA。3組放入28.5℃的飼養(yǎng)箱里。48 hpf時(shí)，清洗24孔板上的加藥孔，重新?lián)Q液加藥。72 hpf時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)SIVs及ISVs的影響。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)基因表達(dá) 選擇狀態(tài)良好，發(fā)育至21 h的斑馬魚(yú)胚胎，除去卵殼，將其放入含飼養(yǎng)液(含VRKI 500 ng/mL)的12孔板中(每孔不少于30個(gè))，在飼養(yǎng)箱里處理3 h，用飼養(yǎng)液清洗3～4遍，再加入Tan ⅡA處理24 h，然后提取不同濃度組別的RNA。每組至少30條胚胎，利用RNeasy Mini Kit (美國(guó)Qiagen)將RNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA，利用7500 Real-time PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems)進(jìn)行擴(kuò)增PCR和基因表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(美國(guó)Invitrogen)。斑馬魚(yú)β-actin-1引物為5′-CAA GAT TCC ATA CCC AGG AAG GA-3′(F) 和5′-CAA GAT TCC ATA CCC AGG AAG GA-3′(R); 斑馬魚(yú)flk-1A(kdrl)引物為5′-GAC CAT AAA ACA AGT GAG GCA GAA G-3′(F) 和5′-CTC CTG GTT TGA CAG AGC GAT A-3′(R); 斑馬魚(yú)flk-1B(kdr)引物為5′-CAA GTA ACT CGT TTT CTC AAC CTA AGC-3′(F)和5′-GGT CTG CTA CAC AAC GCA TTA TAA C-3′(R); 斑馬魚(yú)flt-1引物為5′-AAC TCA CAG ACC AGT GAA CAA GAT C-3′(F) 和5′-GCC CTG TAA CGT GTG CAC TAA A-3′(R)。

2 結(jié) 果

2.1 Tan ⅡA對(duì)健康斑馬魚(yú)SIVs的影響 72 hpf時(shí)，健康轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，50、100、200 μmol/L Tan ⅡA并沒(méi)有引起正常斑馬魚(yú)SIVs區(qū)域的異常變化；對(duì)照組SIVs區(qū)域是1個(gè)類似于籃網(wǎng)的光滑拱形結(jié)構(gòu)，內(nèi)部有4～6根血管(圖1)。Tan ⅡA組拱形血管外圍未出現(xiàn)與對(duì)照組具有顯著差異的尖銳出芽血管，說(shuō)明在最高無(wú)毒濃度(200 μmol/L)下，Tan ⅡA并不會(huì)干擾斑馬魚(yú)機(jī)體自身的血管新生平衡，安全性較好。

2.2 Tan ⅡA對(duì)VRKI誘導(dǎo)的血管損傷斑馬魚(yú)模型胚胎血管的保護(hù)作用 72 hpf時(shí)，在VRKI誘導(dǎo)的血管損傷轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型中，對(duì)照組的SIVs區(qū)域是一個(gè)類似于籃網(wǎng)的光滑拱形結(jié)構(gòu)，內(nèi)部有4～6根血管(圖2A紅色框內(nèi))；ISVs區(qū)域完整，平均血管數(shù)目為27根，完好連接DA和DLAVs(圖2A黃色框內(nèi))。而VRKI組ISVs和SIVs以及DLAVs都出現(xiàn)了明顯的缺失，平均有(0.74±0.56)根完整ISVs及(3.40±1.45)根非完整型ISVs。Tan ⅡA組處理48 h后，SIVs及ISVs均逐漸恢復(fù)，并呈濃度依賴性(圖2A)。尤其在200 μmol/L Tan ⅡA組中，完整ISVs平均有(23.55±1.04)根，非完整ISVs平均有(3.36±1.97)根，與對(duì)照組接近(圖2B)。另外，Tan ⅡA組處理48 h與24 h的血管數(shù)目明顯增多，說(shuō)明Tan ⅡA不僅對(duì)VRKI誘導(dǎo)前期的血管有保護(hù)作用，也在后期起到促血管新生作用。

2.3 Tan ⅡA對(duì)VEGF關(guān)鍵基因mRNA影響的real-time PCR檢測(cè)結(jié)果 為了確定Tan ⅡA在缺血性斑馬魚(yú)模型中的安全性和促血管新生作用，進(jìn)一步用real-time PCR分析VEGF信號(hào)通路上幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)變化。結(jié)果(圖3)顯示：在健康斑馬魚(yú)模型中，與對(duì)照組相比，Tan ⅡA在50、100、200 μmol/L濃度下均沒(méi)有引起flk-1A、 flk-1B、flt-1 mRNA的基因表達(dá)變化(圖3A)。在VRKI誘導(dǎo)的缺血性斑馬魚(yú)模型中，Tan ⅡA呈劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)由VRKI引起的flk-1A、flk-1B、flt-1 mRNA的基因表達(dá)下降。其中，200 μmol/L Tan ⅡA處理后flk-1A表達(dá)是VRKI組的2.32倍(P<0.05), flk-1B是1.79倍(P<0.05)，flt-1是2.78倍(P<0.01，圖3B)。這些結(jié)果表明，Tan ⅡA不會(huì)引起正常斑馬魚(yú)的基因表達(dá)變化，較安全；而在VRKI誘導(dǎo)的缺血斑馬魚(yú)模型中，Tan ⅡA能夠逆轉(zhuǎn)3個(gè)VEGF關(guān)鍵基因的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促血管新生。

圖2 丹參酮ⅡA磺酸鈉(Tan ⅡA)對(duì)VRKI誘導(dǎo)Tg(fli1α∶EGFP)y1斑馬魚(yú)ISVs和SIVs血管損傷模型的保護(hù)作用

圖3 丹參酮ⅡA磺酸鈉(Tan ⅡA)對(duì)健康及VRKI誘導(dǎo)Tg(fli1α∶EGFP)y1斑馬魚(yú)VEGF相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

在我國(guó)，缺血性心臟病已成為僅次于腦血管疾病的第二大致死疾病，嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康和生命安全。其中，男性中每10萬(wàn)人就有137.6人死于缺血性心臟病，而女性也有95.1人死于此病[8]。而血管新生不足是缺血性心臟病的共同病理基礎(chǔ)。大量藥理和臨床研究已表明，活血化瘀類中藥對(duì)諸多缺血性疾病有一定的療效，其中Tan ⅡA已在臨床上廣泛應(yīng)用。Tan ⅡA是改善微循環(huán)的常用藥，但其在血管新生方面的研究較有限。本研究觀察了Tan ⅡA對(duì)斑馬魚(yú)模型的促血管新生作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

在斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中，其腦部血管在初期就有著極其復(fù)雜的蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而在后期能衍生出更加復(fù)雜且難以觀察的血管，這不利于我們實(shí)驗(yàn)觀察。但斑馬魚(yú)的SIVs和ISVs區(qū)域內(nèi)血管在發(fā)育初期清晰可見(jiàn)，利于觀察和統(tǒng)計(jì)，較易獲得客觀可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]。在健康斑馬魚(yú)模型中，將SIVs的光滑拱形結(jié)構(gòu)外圍出芽作為血管新生的評(píng)判依據(jù)[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，VRKI能引起斑馬魚(yú)SIVs和ISVs區(qū)域的丟失，并使斑馬魚(yú)胚胎的血管新生過(guò)程受阻。由此，本研究利用VRKI來(lái)建立血管損傷斑馬魚(yú)模型。在此基礎(chǔ)上，探討Tan ⅡA對(duì)VRKI損傷血管的保護(hù)和修復(fù)效果，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)Tan ⅡA在缺血性心臟病、冠心病以及局部缺血、植入手術(shù)等提供理論依據(jù)。VEGF受體(VEGFRs)在血管新生過(guò)程中起促進(jìn)作用[12]，調(diào)節(jié)VEGFR1的flt-1基因以及VEGFR2的flk-1A(kdrl)、flk-1B(kdr)基因作為VEGFRs的關(guān)鍵基因，均被作為目標(biāo)基因檢測(cè)。本研究結(jié)果表明：在健康轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型中，Tan ⅡA并不會(huì)明顯刺激SIVs區(qū)域出芽，也未引起flt-1、flk-1A(kdrl)和flk-1B(kdr)基因的表達(dá)變化，因此不會(huì)干擾血管新生平衡，說(shuō)明安全性較好，與研究[13-15]結(jié)果一致；而在VRKI損傷模型中，Tan ⅡA顯示了強(qiáng)效的恢復(fù)ISVs和SIVs的效果。

綜上所述，本研究表明Tan ⅡA在缺血性斑馬魚(yú)模型中通過(guò)上調(diào)VEGF信號(hào)通路上flt-1、flk-1A(kdrl)、 flk-1B(kdr)表達(dá)來(lái)促血管新生和保護(hù)血管，且安全性良好，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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[本文編輯] 姬靜芳

The angiogenic effect and potential mechanism of sodium tanshinone ⅡA sulfonate in ischemic zebrafish model

CHEN Fei1, QIAO Qi1, WANG Zhang-sheng1, XU Peng1, LU Gang2*

1. Department of Cardiology, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China 2. Department of Emergency, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective： To investigate the angiogenic effect and potential mechanism of sodium tanshinone ⅡA sulfonate (Tan ⅡA) in ischemic zebrafish model. Methods： Vascular endothelial growth factor receptor kinase inhibitor (VRKI) was used to induce vascular injury in zebrafish model. Then the ischemic zebrafish model was treated with 50, 100, 200 μmol/L Tan ⅡA, respectively. The effects of Tan ⅡA on ischemic zebrafish subintestinal veins (SIVs) and intersegmental vessels (ISVs) were observed. Meanwhile, the expression changes of three vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway-related genes (flt-1, flk-1A, flk-1B) were detected by real-time PCR. Results： In VRKI-induced vascular injury zebrafish model, Tan ⅡA gradually restored ISVs and SIVs in a concentration-dependent manner, reversed the down-regulated expressions of three key VEGF signaling pathway-related genes (flt-1, flk-1A, flk-1B), and promoted angiogenesis. Conclusions： In the ischemic zebrafish model, Tan ⅡA plays a role in angiogenesis and vascular protection by regulating VEGF signaling pathway.

sodium tanshinone ⅡA sulfonate; angiogenesis; zebrafish; vascular endothelial growth factor

2016-09-07 [接受日期] 2017-01-03

陳 飛, 碩士, 主治醫(yī)師. E-mail: chenmilan@hotmail.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-24289511, E-mail: xiaogangg@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160674

R 285

A