徐奇友，王金革，王連生，王常安，李晉南，趙志剛，羅亮，都雪，李偉忠

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.濰坊學(xué)院，山東濰坊261061）

巨大芽孢桿菌對雜交鱘消化酶活性和腸道形態(tài)影響

徐奇友1,2，王金革1,2，王連生1，王常安1，李晉南1，趙志剛1，羅亮1，都雪1，李偉忠3

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.濰坊學(xué)院，山東濰坊261061）

研究旨在探討植物蛋白源飼糧基礎(chǔ)上添加巨大芽孢桿菌對雜交鱘（Acipenser schrenckii♀×Acipenser baeri♂）幼魚消化酶活性和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。以魚粉（FM）組和植物蛋白源（PM）組為對照，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別在PM組基礎(chǔ)上添加105、106和107cfu·g-1巨大芽孢桿菌。選用初始平均體重為（12.87±0.65）g雜交鱘625尾，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)置5個平行。結(jié)果表明，試驗Ⅰ組腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著差異（P＞0.05）。試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組幽門盲囊和瓣腸淀粉酶活性顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著差異（P＞0.05）。試驗Ⅰ組胃脂肪酶、淀粉酶活性和十二指腸絨毛高度顯著高于其他組（P＜0.05）。試驗Ⅰ組瓣腸絨毛高度和褶皺深度顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著差異（P＞0.05），其肌層厚度顯著高于其他各組（P＜0.05）。綜上，植物蛋白源飼糧中添加適宜水平巨大芽孢桿菌可增強(qiáng)雜交鱘幼魚機(jī)體消化酶活性并改善腸道形態(tài)，巨大芽孢桿菌適宜添加水平為105cfu·g-1。

雜交鱘；巨大芽孢桿菌；消化酶；腸道形態(tài)

芽孢桿菌是普遍存在于養(yǎng)殖環(huán)境中的腐生革蘭氏陽性菌，通過攝食行為進(jìn)入動物胃腸道，與宿主形成共生關(guān)系，維持消化道微生態(tài)平衡，具有提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)消化、改善腸道形態(tài)、提高飼糧利用率等作用[1-2]，不利環(huán)境下以孢子形式存在，穩(wěn)定性好、耐高溫、擠壓和溫度變化，耐受配合飼糧制作條件。具有無殘留、無毒副作用、無抗藥性、環(huán)境友好等特點，成為生理學(xué)、免疫學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等學(xué)科研究熱點[3]。

Kozasa首次將芽孢桿菌應(yīng)用于水生動物，效果良好[4]，芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域研究應(yīng)用受到關(guān)注[5]。Aly等試驗表明，飼糧中添加芽孢桿菌可改善水生動物腸道形態(tài)、顯著提高非特異性免疫能力和消化酶活性[6-8]。目前，巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）研究主要集中在菌株篩選、有機(jī)物及氮代謝能力[9-11]及作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中應(yīng)用等方面[12-13]。

馬恒甲等研究表明，高植物蛋白源飼糧影響水產(chǎn)動物消化酶活性和生長性能[14-15]，飼糧中加入適量芽孢桿菌可增強(qiáng)養(yǎng)殖動物機(jī)體消化酶活性并促進(jìn)其健康生長[16-17]。本研究在植物蛋白源飼糧基礎(chǔ)上添加不同水平巨大芽孢桿菌，探討其對雜交鱘幼魚消化酶活性和腸道形態(tài)影響，為巨大芽孢桿菌在鱘魚植物蛋白源飼糧中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

由黑龍江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖室水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥中分離獲得巨大芽孢桿菌菌株，經(jīng)30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)菌液。使用前平板計數(shù)法測定制劑中巨大芽孢桿菌數(shù)目。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

挑選體格健壯、規(guī)格整齊雜交鱘幼魚（購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心）1 500尾，暫養(yǎng)并馴化2周，暫養(yǎng)時投喂植物蛋白源飼糧，2周后選用初體重為（12.87±0.65）g雜交鱘625尾，隨機(jī)分為5組，每組設(shè)5個平行，試驗周期為56 d。以褐魚粉、豆粕、豆油和魚油等為主要原料配制魚粉蛋白源飼糧（FM組），以大豆?jié)饪s蛋白、豆粕、豆油和魚油等為主要原料配制植物蛋白源飼糧（PM組），配方原料組成見表1。

由表1可知，在植物蛋白源飼糧基礎(chǔ)上，分別加入105（Ⅰ組）、106（Ⅱ組）、107cfu·g-1（Ⅲ組）巨大芽孢桿菌配制5種試驗用飼糧。飼糧原料粉碎過40目篩，按配方比例稱重后混合均勻，加入油脂后與水或巨大芽孢桿菌、水混合物充分混勻，制粒機(jī)制作粒徑適宜飼糧，室溫風(fēng)干，裝袋后保存于-20℃冰箱。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis)(%)

1.3 飼養(yǎng)管理

在25個160 L可控溫循環(huán)式水族箱內(nèi)飼養(yǎng)，水溫控制（21±0.5）℃，試驗期間每天7:00、12:00、17:00飽食投喂，及時吸取殘餌和糞便，每周更換箱內(nèi)2/3水量，兩天檢測1次水質(zhì)，溶氧＞5 mg·L-1，pH 7.9～8.3，氨氮濃度≤0.05 mg·L-1。自然光照，每天記錄雜交鱘幼魚攝食和死亡情況。

1.4 腸道消化酶活性測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，停止投喂1天，腸胃內(nèi)容物排空，每缸隨機(jī)選取3尾魚，冰盤中快速解剖，取出肝臟、胃、幽門盲囊、十二指腸和瓣腸，冰浴0.86%氯化鈉溶液沖洗內(nèi)容物，濾紙吸去腸道表面水分。按1∶9質(zhì)量體積比加入配制0.86%氯化鈉溶液，試管放入冰盒中FJ-200CL高速勻漿機(jī)組織勻漿，4℃4 000 r·min-1離心10 min，組織勻漿上清液用1.5 mL離心管分裝，置于-20℃冰箱，測定各組織消化酶活性。

測定蛋白酶活性采用福林-酚（Folin-phenol）法，試驗底物為0.5%酪素，將1 mL酶粗提液37℃處理5 min后，添加酪素37℃處理15 min，加入10%三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取上清液1 mL加入0.55 mol·L-1Na2CO35 mL，1 mL福林-酚試劑，其在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原，在680 nm波長下，以對照管調(diào)零，作比色測定吸光度。淀粉酶和脂肪酶活性試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 腸道形態(tài)測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選3尾魚，冰盤中快速解剖，丁香油完全麻醉后分離十二指腸和瓣腸，0.86%氯化鈉溶液沖洗內(nèi)容物，Bouin氏液中固定24 h，經(jīng)乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（5 um）、蘇木精-伊紅（H.E.）染色、脫水、透明、中性樹脂封片。Leica MD-4000B拍照，Motic Images Plus 2.0測量樣本長度，每段樣品均測量15個以上絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度和褶皺深度，取平均值。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 19.0軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）作數(shù)據(jù)處理，Duncan氏法作顯著性檢驗，差異顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚蛋白酶活性影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚各組織蛋白酶活性影響見表2，結(jié)果表明，試驗Ⅰ組十二指腸和瓣腸蛋白酶活性顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著差異（P＞0.05）；試驗Ⅰ組和Ⅱ組胃蛋白酶活性顯著高于PM、FM組（P＜0.05）；試驗Ⅰ組胃、幽門盲囊、十二指腸和瓣腸蛋白酶活性高于試驗Ⅱ、和Ⅲ組，但差異不顯著（P＞0.05）；各試驗組肝臟蛋白酶活性均無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚蛋白酶活性影響（n=5）Table 2Effect of Bacillus megaterium on protease activity of juvenile hybrid sturgeon(U·g-1prot)

2.2 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚淀粉酶活性影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚各組織淀粉酶活性影響見表3，結(jié)果表明，試驗Ⅱ組胃、幽門盲囊、十二指腸和瓣腸淀粉酶活性顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著性差異（P＞0.05）；試驗Ⅰ組胃淀粉酶活性顯著高于其他各組（P＜0.05）；試驗Ⅰ組幽門盲囊淀粉酶活性高于試驗Ⅱ、Ⅲ組，但無顯著性差異（P＞0.05）；各試驗組間肝臟淀粉酶活性均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚脂肪酶活性影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚各組織脂肪酶活性影響見表4，結(jié)果表明，試驗Ⅰ、Ⅱ組十二指腸、瓣腸的脂肪酶活性顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著性差異（P＞0.05）；試驗Ⅰ組胃和幽門盲囊脂肪酶活性顯著高于其他各組（P＜0.05），試驗Ⅰ組十二指腸脂肪酶活性高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，但無顯著性差異（P＞0.05）；各試驗組間肝臟脂肪酶活性均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚淀粉酶活性影響（n=5）Table 3Effect of Bacillus megaterium on amylase activity of juvenile hybrid sturgeon(U·g-1prot)

2.4 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚十二指腸形態(tài)影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚十二指腸形態(tài)影響見表5，結(jié)果表明，試驗Ⅱ組絨毛高度和褶皺深度顯著高于PM組（P＜0.05），與FM組無顯著性差異（P＞0.05）；試驗Ⅰ組絨毛高度顯著高于其他各組（P＜0.05）；試驗Ⅰ組肌層厚度顯著高于PM組（P＜0.05），且與FM組無顯著性差異（P＞0.05）；各試驗組絨毛寬度均無顯著性差異（P＞0.05）。各組十二指腸切片如圖1所示，F(xiàn)M組和試驗Ⅰ組的腸絨毛排列整齊緊密，發(fā)育良好，且絨毛長度和褶皺深度明顯大于PM組。

2.5 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚瓣腸形態(tài)影響

巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚瓣腸形態(tài)影響見表6，結(jié)果表明，試驗Ⅰ組絨毛高度和褶皺深度顯著高于PM組（P＜0.05），且與FM組無顯著差異性（P＞0.05），肌層厚度顯著高于PM和FM組（P＜0.05）；試驗Ⅰ組絨毛高度、肌層厚度和褶皺深度顯著高于Ⅱ和Ⅲ組（P＜0.05）；各試驗組絨毛寬度均無顯著性差異（P＞0.05）。

各組瓣腸切片如圖2所示，F(xiàn)M和Ⅰ組瓣腸發(fā)育良好，絨毛高度和肌層厚度均明顯高于其他各組。

表4 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚脂肪酶活性影響（n=5）Table 4Effect of Bacillus megaterium on lipase activity of juvenile hybrid sturgeon(U·g-1prot)

表5 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚十二指腸形態(tài)影響（n=5）Table 5Effect of Bacillus megaterium on duodenum morphology of juvenile hybrid sturgeon(μm)

圖1 雜交鱘幼魚十二指腸組織切片F(xiàn)ig.1Tissue slice of duodenum of juvenile hybrid sturgeon

圖2 雜交鱘幼魚瓣腸組織切片F(xiàn)ig.2Tissue slice of valvula intestine of juvenile hybrid sturgeon

表6 巨大芽孢桿菌對雜交鱘幼魚瓣腸形態(tài)影響（n=5）Table 6Effect of Bacillus megaterium on valvula intestine morphology of juvenile hybrid sturgeon(μm)

3 討論

植物蛋白源含抗?fàn)I養(yǎng)因子，氨基酸不均衡，適口性差，水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率低[18]。虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[19]、埃及鰨（Soleaa aegyptiaca）[20]、大西洋鮭（Salmo salar）[21]等相關(guān)研究均有報道。Kaushik等研究表明，大豆蛋白源替代魚粉飼糧＞50%降低虹鱒生長性能[19]。Torstensen等研究表明，植物蛋白源和植物油替代魚粉和魚油飼糧投喂大西洋鮭，高替代組特定生長率低于其他組[21]。本試驗在飼糧中加入105cfu·g-1巨大芽孢桿菌時，雜交鱘幼魚十二指腸和瓣腸脂肪酶活性、蛋白酶活性，幽門盲囊和瓣腸淀粉酶活性顯著高于PM組。說明飼糧中添加適宜水平巨大芽孢桿菌可促進(jìn)植物蛋白源吸收和利用，改善動物生長性能，原因是①巨大芽孢桿菌孢子進(jìn)入動物機(jī)體后，在腸道內(nèi)復(fù)蘇并繁殖代謝，分泌多種水解酶，進(jìn)入消化道中，將植物蛋白源飼糧降解，提高飼糧轉(zhuǎn)化率，改善生長性能[22]。沈斌乾等研究表明，將枯草芽孢桿菌添加到飼糧中投喂4.16 g青魚魚種56 d，顯著提高魚種后腸蛋白酶和淀粉酶活性[23]。Wang等研究表明，在飼糧中添加1×107cfu·g-1芽孢桿菌投喂6.5 g鯉魚60 d，顯著增強(qiáng)鯉魚腸道消化酶活性[24]。江永明等報道，將添加3.0×108cfu·g-1枯草芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的飼糧投喂奧尼羅非魚，顯著提高其肝胰臟和胃蛋白酶活性[25]。②巨大芽孢桿菌在魚類腸道內(nèi)代謝繁殖，可分泌氨基酸和有機(jī)酸，降低腸道pH，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)尤其是蛋白質(zhì)消化利用，提高雜交鱘幼魚植物蛋白質(zhì)利用率[26]。③巨大芽孢桿菌代謝物可降解植物蛋白源中抗?fàn)I養(yǎng)因子（如植酸），芽孢桿菌發(fā)酵液中存在植酸酶[27-28]，降解植酸，釋放與其結(jié)合蛋白質(zhì)，抑制內(nèi)源性消化酶與植酸結(jié)合[29]，促進(jìn)雜交鱘幼魚對植物蛋白質(zhì)吸收利用。④從腸道切片結(jié)果可見，在飼糧中添加105cfu·g-1巨大芽孢桿菌時，十二指腸和瓣腸絨毛高度和褶皺深度顯著高于PM組，腸絨毛排列整齊，腸道發(fā)育良好，表明添加適宜水平巨大芽孢桿菌可提高消化酶活性，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，與王華等在飼糧中添加一定量益生菌，改善動物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致[30]。添加芽孢桿菌均可促進(jìn)陸生和水生動物腸道發(fā)育，改善腸道形態(tài)[31-34]。腸絨毛為機(jī)體吸收和轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)最重要結(jié)構(gòu)[35]。絨毛高度反映動物腸道與營養(yǎng)物質(zhì)接觸面積及對營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用能力。芽孢桿菌促進(jìn)腸道蠕動，增強(qiáng)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力[36]。因此，飼糧中加入適量巨大芽孢桿菌可有效防止雜交鱘幼魚腸黏膜萎縮并維持腸道結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)養(yǎng)殖動物機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收能力，促進(jìn)植物蛋白質(zhì)吸收和利用。

本試驗結(jié)果顯示，隨著巨大芽孢桿菌添加水平增加，消化酶活性逐漸降低，過量添加導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡，機(jī)體免疫功能紊亂，改變腸粘膜透性，影響腸道健康發(fā)育。沈文英和管越強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)添加芽孢桿菌量超過一定限度，機(jī)體消化酶活性下降[37-38]。原因是魚類腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境處于動態(tài)平衡，添加菌量過多或過少，菌群結(jié)構(gòu)失衡，過量則抑制魚類機(jī)體內(nèi)源酶活性，減弱對飼料中相應(yīng)營養(yǎng)成分降解作用，營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力降低。

4 結(jié)論

a.植物蛋白源飼糧基礎(chǔ)上添加適宜水平巨大芽孢桿菌可顯著提高雜交鱘幼魚消化酶活性并改善腸道形態(tài)。

b.本試驗條件下綜合組織消化酶活性和腸道形態(tài)指標(biāo)，巨大芽孢桿菌適宜添加水平為105cfu·g-1。

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Effect ofBacillus megateriumto plant protein meal on digestive enzyme activity and intestinal morphology of juvenile hybrid sturgeon/

XU Qiyou1,2,WANG Jinge1,2,WANG Liansheng1,WANG Changan1,LI Jinnan1,ZHAO Zhigang1, LUO Liang1,DU Xue1,LI Weizhong3(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.School of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Weifang University,Weifang Shandong 261061,China)

This experiment was conducted to study the effect of addingBacillus megateriumto plant protein meal on digestive enzyme activity and intestinal morphology of juvenile hybrid sturgeon (Acipenser schrenckii♀×Acipenser baeri♂).The fish in the 3 experimental groups were fed plantprotein meal(group PM)with 105cfu·g-1(groupⅠ),106cfu·g-1(groupⅡ)and 107cfu·g-1Bacillus megaterium(groupⅢ),respectively,taking the fish meal(group FM)and group PM as control groups. A total of 625 hybrid sturgeon with an initial body weight of(12.87±0.65)g were randomly divided into 5 groups with 5 replicates and 25 fish per replicate.The results showed that the protease and lipase activity were significantly higher in intestine in groupⅠcompared with the group PM(P＜0.05),and had no significant difference with the group FM(P＞0.05).The amylase activity were significantly higher in pyloric caeca and valvula intestine in groupⅠ,groupⅡand groupⅢcompared with the group PM(P＜0.05),and had no significant difference with the group FM(P＞0.05).The amylase,lipase activity in stomach and the villus height in duodenum were significantly higher in groupⅠcompared with other groups(P＜0.05).The muscular thickness were significantly higher in valvula intestine in groupⅠcompared with other groups(P＜0.05),the villus height and folds depth were significantly higher compared with the group PM(P＜0.05),and had no significant difference with the group FM(P＞0.05).In conclusion,the addition ofBacillus megateriumto plant protein meal can promote intestinal morphology development and increase digestive enzyme activity.Under the condition of this experiment,the supplemental level ofBacillus megateriumin diets is suggested to be 105cfu·g-1.

hybrid sturgeon;Bacillus megaterium;digestive enzyme;intestinal morphology

S965.215

A

1005-9369（2017）05-0050-08

時間2017-5-23 12:29:30[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170523.1229.012.html

徐奇友,王金革,王連生,等.巨大芽孢桿菌對雜交鱘消化酶活性和腸道形態(tài)影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(5):50-57.

Xu Qiyou,Wang Jinge,Wang Liansheng,et al.Effect ofBacillus megateriumto plant protein meal on digestive enzyme activity and intestinal morphology of juvenile hybrid sturgeon[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(5):50-57.(in Chinese with English abstract)

2016-03-28

黑龍江水產(chǎn)研究所基本科研項目（HSY201407）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項（201003055）；濰坊學(xué)院青年科研基金項目（2012Z19）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-46）

徐奇友（1969-），男，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為水生動物營養(yǎng)學(xué)。E-mail:xuqiyou@sina.com