尤妍

（玉環(huán)縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州317608）

高效液相色譜測(cè)定雪糕中6種合成色素

尤妍

（玉環(huán)縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州317608）

建立一種簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的高效液相色譜可見光測(cè)定雪糕中的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)6種合成著色劑。以無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）為溶劑提取，HLB固相萃取柱凈化，ZORBAXSB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相以甲醇和20 mmol/L乙酸銨進(jìn)行梯度洗脫。流速1.0 mL/min，柱溫25℃，多波長同時(shí)測(cè)定6種的合成色素，檢測(cè)波長分別為428、521、509、483、507、625 nm。結(jié)果表明：6種合成色素均達(dá)到基線分離，在0.1 μg/mL～10 μg/mL范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系（R2均大于0．999 9）；樣品的樣品加標(biāo)回收率85%～110%，精密度RSD均小于2.0%。該方法可用于檢測(cè)雪糕中合成色素的含量。

合成色素；雪糕；高效液相色譜

合成著色劑是指用人工化學(xué)合成方法制得的有機(jī)色素，主要是以煤焦油中分離出來的苯胺染料為原料制成。合成著色劑在體內(nèi)蓄積分解成致突變?cè)绑w芳香胺類化合物，有些可能會(huì)轉(zhuǎn)化成致癌物質(zhì)[1-3]，過量攝入合成著色劑危害人體健康。若兒童過量食用含合成色素的食品，會(huì)影響兒童智力發(fā)育。同時(shí)也會(huì)干擾兒童正常的代謝功能。

雪糕中添加合成色素可以促進(jìn)人們的食欲，提高食品的商品價(jià)值，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)這6種合成色素在雪糕中最大使用量作了明確規(guī)定[4]。

目前合成著色劑的測(cè)定方法有高效液相色譜法[5-11]、毛細(xì)管電泳法[12-13]、液質(zhì)聯(lián)用法[14]。一般采用GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》和SN/ T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè)》的高效液相色譜法測(cè)定食品中的合成著色劑[15-16]，但是該方法未提及雪糕中著色劑測(cè)定的前處理方法，而且雪糕中含有穩(wěn)定劑，按照GB/T 5009.35-2003的方法進(jìn)行前處理，極易堵塞砂芯漏斗。因此，建立檢測(cè)雪糕中的合成色素的測(cè)定方法具有重要意義。本試驗(yàn)旨在發(fā)現(xiàn)一種簡(jiǎn)便、可行的檢測(cè)方法，為雪糕中色素的檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器、四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Open LAB工作站）：安捷倫科技有限公司；梅特勒XS205DH電子天平（萬分之一）：梅特勒；DV-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；Neofuge 18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

甲醇、乙腈：HPLC級(jí)，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣；3%氨水溶液：取氨水3 mL，加水定容至100 mL；乙酸銨溶液（20 mmol/L）：取1.54 g乙酸銨，加水溶解至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣；鹽酸-乙醇溶液：取10 mL鹽酸，90 mL乙醇，混勻；50%甲醇：取50 mL甲醇，50 mL水，混勻；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)、日落黃（0.50 mg/mL）：中國計(jì)量科學(xué)研究院；誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取60.24 mg誘惑紅（純度83%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）用水定容至100mL，配制成0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2 樣品

雪糕：市售。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇為A相，20 mmol/L乙酸銨為B相，按照梯度程序洗脫（見表1）。流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長分別為：428、521、509、483、507、625 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 最佳梯度洗脫程序Table 1 Optimal elution conditions of synthetic pigments by HPLC

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取0.5 mg/mL的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)各5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次配制成濃度為0.1、0.2、0.4、1、3、5、10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。這7個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液各自進(jìn)樣10 μL，按照色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間、峰面積及對(duì)應(yīng)的濃度分別作校準(zhǔn)曲線。

1.5 樣品處理

試樣處理：取完整的雪糕樣品，室溫下化凍，均質(zhì)機(jī)勻漿，作為供試樣品。

稱取2 g樣品（精確至0.01 g）于離心管中，加入乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）溶液約15 mL，置超聲波中超聲5 min，6 000 r/min離心5 min，過濾。再用30 mL乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）溶液重復(fù)提取3次，取濾液，于80℃水浴蒸至5 mL左右，用氨水溶液調(diào)節(jié)pH為8，作為待凈化液。

取HLB凈化小柱，先用8 mL甲醇，8 mL水活化，取待凈化液過小柱，用pH值為8的水和pH值為8的甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶1，體積比）各5 mL淋洗小柱，鹽酸-乙醇溶液10 mL洗脫，洗脫液用氨水調(diào)至中性，80℃水浴蒸至近干，用50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，作為樣品供試溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長選擇

利用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)分別進(jìn)行波長掃描見圖1。

圖1 6種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品的紫外-可見光譜掃描圖Fig．1 UV-Visible spectra of six kinds of synthetic pigments

由圖1可知，6種合成色素在紫外波長（254 nm）附近都有較強(qiáng)吸收，但樣品中的一些雜質(zhì)在該波長下有吸收，影響目標(biāo)色素的判斷（圖2）。因此，采用可見光吸收波長作為檢測(cè)波長。確定了檸檬黃的測(cè)定波長為428 nm，莧菜紅的測(cè)定波長為521 nm，胭脂紅的測(cè)定波長為509 nm,日落黃的測(cè)定波長為483 nm，誘惑紅的測(cè)定波長為507 nm，亮藍(lán)的測(cè)定波長為625 nm。采用以上可見光檢測(cè)，樣品的基質(zhì)干擾少，各組分能有效分離。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及線性關(guān)系

選擇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0.1、0.2、0.4、1、3、5、10 μg/mL，進(jìn)高效液相色譜儀分析后，以各個(gè)組分的峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍性噪比計(jì)算檢出限。6種色素在其0.1 μg/mL～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好（見表2）。取1 μg/mL色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用可見光和紫外光檢測(cè)，結(jié)果（如圖3）：采用可見光檢測(cè)后6種色素的響應(yīng)值較按照GB/T 5009．35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》紫外光檢測(cè)高，亮藍(lán)尤其明顯。

圖2 陽性樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of positive sample

表2 各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限Table 2 The detection limit of components and standard curve

圖3 1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of 1 μg/mL standard solution

2.3 方法精密度和加標(biāo)回收率

取10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算各組分峰面積精密度見表3。以雪糕陽性樣品為試樣，分別加入一定量的混標(biāo)，計(jì)算回收率見表4。結(jié)果表明：6種人工合成色素的精密度均< 2.0%，樣品加標(biāo)回收率85%～110%，該方法適用于雪糕樣品的檢測(cè)。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The precision of the result of the experiments

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 The recovery of the standard addition

2.4 前處理方法的選擇

目前合成色素的提取方法一般采用 GB／T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》的聚酰胺吸附法。試驗(yàn)分析比較了不同顆粒度聚酰胺粉對(duì)空白樣品加標(biāo)的吸附效果見表5。結(jié)果表明聚酰胺粉顆粒度對(duì)合成色素的吸附效果影響較大，顆粒度越小，吸附效果越好，但是＞200目的聚酰胺粉的價(jià)格昂貴，是100目～200目聚酰胺粉價(jià)格的近10倍，考慮100目～200目顆粒度的聚酰胺粉回收率滿足一般檢測(cè)需求，所以一般采用該規(guī)格的聚酰胺粉進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)用聚酰胺粉對(duì)雪糕陽性樣品進(jìn)行處理時(shí)，由于雪糕中含有糖、增稠劑（卡拉膠、槐豆膠、瓜爾膠、羧基纖維素鈉、羅望子多糖膠）等物質(zhì)，在用G3砂芯漏斗（濾片平均濾孔15 μm～40 μm）洗脫的過程中出現(xiàn)砂芯堵塞、洗脫困難的現(xiàn)象。為解決這一難題，特采用乙醇-氨水-水提取的方法，先將目標(biāo)色素提取出來，再利用HLB凈化小柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，排除干擾。

表5 不同顆粒度的提取效果Table 5 Extraction efficiencys of differents granularity

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，利用高效液相色譜可見光測(cè)定雪糕中6種合成色素，能更精確地測(cè)定目標(biāo)物，避免了一些干擾，各組份分離效果較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好。同時(shí)，改進(jìn)了樣品前處理方法，避免了樣品洗脫困難的發(fā)生，且方法回收率較高。試驗(yàn)證明，該方法適合雪糕樣品中合成色素的含量的檢測(cè)。

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Determination of Six Synthetic Pigments in Ice Cream by High Performance Liquid Chromatography

YOU Yan
（The Inspection Testing Center of Food and Drug in YuHuan，Taizhou 317608，Zhejiang，China）

To develop a method for the determination of six synthetic pigments such as tartrazine，amaranth，carmine，sunset yellow，temptation red，brilliant blue，fancy red in ice cream.Using anhydrous ethanol-ammonia-water（7∶2∶1，V/V）as solvent extraction，the synthetic pigments were cleaned by HLB cartridge.After exreacetd，samples were separated in a ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）column with gradient program by using methanol and 20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min，with the column temperature 40℃and detection wave 428，521，509，483，507，625 nm.The six synthetic pigments were separated.The linear range of menthod was in the range of 0.1 μg/mL-10 μg/mL：（R2＞0.999 9）.The recoveries for samples ranged from 85%-110%，and RSD were all below 2%.This methods were suitable for determination of synthetic colout in ice cream.

synthetic colorants；ice cream；high performance liquidchromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.032

2016-09-23

尤妍（1986—），女（漢），碩士研究生，工程師，研究方向：食品檢測(cè)。