劉良琴，龔小見，周欣，*，趙超，陳華國

（1.貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽550001；2.貴州師范大學貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術工程實驗室，貴州貴陽550001；3.貴州師范大學天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州貴陽550001）

靈芝紅茶抗氧化活性成分的含量測定研究

劉良琴1，2，3，龔小見1，2，3，周欣1，2，3，*，趙超1，2，3，陳華國1，2，3

（1.貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽550001；2.貴州師范大學貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術工程實驗室，貴州貴陽550001；3.貴州師范大學天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州貴陽550001）

以靈芝紅茶為研究對象，應用DPPH·、ABTS+·和FRAP鐵離子還原能力研究靈芝紅茶的抗氧化活性，并對靈芝紅茶中茶多酚和多糖含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝紅茶有清除DPPH自由基、ABTS+自由基和還原FRAP的作用，表明靈芝紅茶具有較強的抗氧化活性。靈芝紅茶中的茶多酚和多糖含量測定方法中，沒食子酸濃度在4.08 μg/mL～16.50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，平均回收率分別為99.6%（RSD=2.52%，n=9）；葡萄糖濃度在40.33 μg/mL～181.50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為100.5%（RSD=1.08%，n=9）。所建立的靈芝紅茶中茶多酚和多糖的含量測定方法簡便快捷，線性、重復性、精密度和回收率良好。此含量測定方法可用于靈芝紅茶生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制。

靈芝紅茶；茶多酚；多糖；抗氧化

大量研究證明人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基及其反應會加速衰老以及誘導各種生活習慣病的發(fā)生。抗氧劑能有效清除活性氧自由基，減緩人體衰老，預防疾病。目前，合成抗氧劑在醫(yī)療和食品領域使用較為廣泛，研究表明合成抗氧劑對生物體有潛在的毒副作用[1]。因此，尋找開發(fā)安全無毒副作用的天然抗氧化劑成為當下的研究熱點[2]，而保健品的研究開發(fā)是一個重要的研究方向。

靈芝紅茶是以靈芝和紅茶為原料生產(chǎn)的一種具有保健功能的飲品，它同時具有靈芝和紅茶的保健功效。靈芝（Ganderma lucidum）具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、提高機體耐缺氧能力[3-4]等活性；茶葉具有提神消疲、養(yǎng)胃護胃、抗衰老、抗癌[5-6]等功效?？茖W研究表明，茶多酚是紅茶中主要活性成分，而多糖類是靈芝提取物中主要活性成分。本文采用體外抗氧化試驗對靈芝紅茶的抗氧化活性進行初步評價研究，在抗氧化活性研究的基礎上，以茶多酚和靈芝多糖為評價指標，采用Folin-Ciocalteu法[7]和苯酚-硫酸法[8]建立了靈芝紅茶中茶多酚和多糖含量測定方法，該方法簡便快捷，線性、重復性、精密度和回收率良好，可用于控制靈芝紅茶產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)過程中產(chǎn)品質(zhì)量的在線監(jiān)測。

1 材料

1.1 主要儀器及試劑

SPECTRA max PLUS 384光吸收酶標儀：美國分子儀器公司Molecular Devices；AL204萬分之一分析天平、XS105十萬分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDL-5A低速自動平衡離心機：常州市萬合儀器制造有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；BSC-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；明澈TM-D 24UV純水/超純水系統(tǒng)：Merck Millipore；Eppendorf research plus微量移液器：德國Eppendorf公司。

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）：貴州迪大生物科技有限公司；TPTZ：Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；福林酚：上海藍季科技有限公司；FeCl3、FeSO4乙酸鈉、濃硫酸、苯酚、無水碳酸鈉：均為分析純；水為蒸餾水；維生素C、沒食子酸、無水葡萄糖：貴州迪大生物科技有限公司（純度≥98%）。

1.2 茶葉材料

靈芝紅茶（批號：020150105、020150615、020150922、020151006、020151028、020151105、020151108、02015-1113、020151105、020151204）：貴州高山黔靈原生態(tài)健康品有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 靈芝紅茶的抗氧化活性

2.1.1 樣品溶液的制備

靈芝紅茶樣品溶液的制備：靈芝紅茶磨碎過20目篩（孔徑為0.833 mm）。精密稱定靈芝紅茶0.2 g，加500.0 mL水，80℃超聲提取30 min，離心（3 500 r/min，5 min）取上清液，重復2次，合并提取液，定容到1 000 mL，得靈芝紅茶樣品溶液。測得其中茶多酚濃度為17.60 μg/mL，總糖濃度為10.50 μg/mL。

VC對照品溶液的制備：精密稱定 VC對照品11.01 mg，水溶解，配制成1.0 mg/mL的樣品液。使用時用蒸餾水將溶液稀釋。

2.1.2 DPPH自由基清除能力的測定[9]

取 0.5 mL靈芝紅茶和 VC稀釋液與 0.5 mL 250 μmol/LDPPH工作液混合，室溫下反應40min，以樣品溶液為空白，在517nm處讀取吸光度值。計算靈芝紅茶、VC對DPPH自由基清除率，結(jié)果見圖1。

SA（清除率）/%=[（AControl-ASample）/AControl]×100

式中：AControl為0.5 mL DPPH溶液與0.5 mL無水乙醇混合后的吸光度；ASample為 0.5 mL DPPH溶液與0.5 mL樣品混合后的吸光度。

圖1 DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH·scavenging activity of Ganoderma lucidum black tea

由圖1可知，VC對DPPH自由基清除效果隨濃度升高而增強，有明顯的量效關系，IC50為11.98 μg/mL；靈芝紅茶的DPPH自由基清除率為91.78%，相當于26.22 μg/mL VC。

2.1.3 ABTS+自由基清除能力的測定[10]

配制ABTS溶液和K2S2O7溶液，按1∶1比例（體積比）混合，使ABTS和K2S2O7最后濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫避光條件下放置12 h，形成ABTS儲備液。使用無水乙醇將儲備液稀釋為ABTS工作液，使其在734 nm處的吸光度值為0.80±0.02。

分別取0.5 mL靈芝紅茶和VC稀釋液與0.5 mL ABTS工作液混合，室溫反應20 min，在734 nm讀取吸光度值，計算茶多酚、VC對ABTS+自由基清除率，結(jié)果見圖2。

SA（清除率）/%=[（AControl-ASample）/AControl]×100

式中：AControl為0.5 mL ABTS工作液與0.5 mL無水乙醇混合后的吸光度；ASample為0.5 mL ABTS工作液與0.5 mL樣品混合后的吸光度。

由圖2可知，VC對ABTS+自由基清除效果隨濃度升高而增強，有明顯的量效關系，IC50為11.18μg/mL；靈芝紅茶的ABTS+自由基清除率為95.87%，相當于23.05 μg/mL VC。

圖2 ABTS+自由基清除率Fig.1 ABTS+·scavenging activity of Ganoderma lucidum black tea

2.1.4 FRAP鐵離子還原能力測定[11]

將10 mmol/L的TPTZ儲備液（用40 mmol/L鹽酸溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用），20 mmol/L的FeCl3溶液和0.3 mmol/L的醋酸緩沖液（pH 3.6）以1∶1∶10（體積比）混合，制成新鮮的FRAP工作液。取濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/LFeSO4溶液各50 μL，加入1.0 mL TPTZ工作夜，測定吸光度值，繪制標準曲線。得曲線方程：y= 0.712 8 x+0.003 5，γ=0.999 4。還原力以FRAP值表示：1 FRAP單位=1 μmol/L FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當于FeSO4的摩爾濃度數(shù)。

取50 μL靈芝紅茶和VC樣品液加入1.0 mL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻，37℃反應40 min后在593 nm處測定吸光度。計算靈芝紅茶、Vc的FRAP值，結(jié)果見圖3。

圖3 FRAP鐵離子還原能力Fig.3 FRAP ferric ion reducing antioxidant powder of Ganoderma lucidum black tea

由圖3可知，VC對FRAP還原能力隨濃度升高而增強，有明顯的量效關系；靈芝紅茶的FRAP值為638，相當于7.48 μg/mL VC。

2.2 靈芝紅茶中茶多酚的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備

經(jīng)過單因素結(jié)合正交試驗，確定靈芝紅茶中茶多酚的提取方法如下：取靈芝紅茶樣品0.2 g，精密稱定，置于三角燒瓶中，加入5.0 mL體積分數(shù)50%的乙醇，超聲提取30 min，離心（3 500 r/min，5 min），取上清液。重復提取兩次。合并提取液，定容到10 mL，搖勻，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品10.0 mg，加水溶解，定容到100 mL，搖勻，配制成100 μg/mL的沒食子酸對照品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇

分別取茶多酚供試品溶液50 μL和沒食子酸對照品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入1.0 mL Folin-Ciocalteu試劑，室溫反應5 min后，加入質(zhì)量分數(shù)為10%NaCO3溶液2.5 mL，定容到10 mL，30℃避光顯色50 min后，于400 nm～800 nm范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果表明：對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為760 nm。

2.2.4 標準曲線的繪制

分別取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL沒食子酸對照品溶液，按照2.2.3項下的方法進行測定。以沒食子酸的濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得曲線方程為y=0.040 23 x+ 0.040 78，γ=0.999 3，結(jié)果表明：沒食子酸濃度在4.084 μg/mL～16.50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3 靈芝紅茶中多糖的含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備

經(jīng)過單因素結(jié)合正交試驗，確定靈芝紅茶中多糖的提取方法如下：取靈芝紅茶樣品0.5 g，精密稱定，置于三角燒瓶中，加入5.0 mL水，在80℃下超聲提取40 min，離心（3 500 r/min，5 min），取上清液。重復提取兩次。合并提取液，加入無水乙醇使乙醇的體積分數(shù)達到80%，于4℃下醇沉24 h后，離心，傾去上清液，洗滌沉淀，干燥，加水溶解轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取無水葡萄糖50.0 mg，加水溶解，定容到50 mL，搖勻，配制成1 mg/mL的對照品貯備液。分別取0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖貯備液，定容到10 mL，得不同濃度的葡萄糖系列標準溶液。

2.3.3 檢測方法的確定

取多糖供試品溶液0.1 mL于10 mL具塞試管中，加水至1.0 mL，取對照品溶液1.0 mL于另一10 mL具塞試管中，分別加入1.0 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚溶液，再加入5.0 mL濃硫酸，沸水浴10 min，放冷，于400 nm～600 nm范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果表明：對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為485 nm。

2.3.4 標準曲線的繪制

取1.0 mL葡萄糖系列標準溶液于試管中，按照2.3.3項下的方法進行處理。以葡萄糖的濃度為橫坐標（x），吸光度值為縱坐標（y）繪制標準曲線。得方程為y=0.003 85x+0.007 08，γ=0.999 6，結(jié)果表明：葡萄糖濃度在40.33 μg/mL～181.50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.4 方法學考察

2.4.1 穩(wěn)定性試驗

取50 μL多酚樣品液6份，按照2.2.3項下的方法處理。以溶劑為空白，分別在0、10、20、30、45、60、90 min后測定吸光度。結(jié)果顯示，多酚樣品液在制備顯色后的90 min內(nèi)穩(wěn)定。

取0.1 mL多糖供試品溶液6份，分別加入0.9 mL水，按照2.3.3項下的方法處理，以溶劑為空白，分別于0、20、40、60、80、100、120 min后測定吸光度。結(jié)果顯示，RSD=2.04%（n=6），表明多糖樣品液在制備顯色后的120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 精密度試驗

分別取1.0 mL 100 μg/mL沒食子酸溶液6份，按照2.2.3項下的方法進行測定。得結(jié)果為0.482、0.482、0.492、0.496、0.481、0.492，平均值為0.488，RSD=1.35%（n=6），表明儀器精密性良好。

分別取1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖溶液6份，按照2.3.3項下的方法進行測定。計算得結(jié)果為0.336、0.338、0.331、0.336、0.332、0.333，平均值為0.334，RSD= 0.82%（n=6）。表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復性試驗

取靈芝紅茶（批號：020150922）樣品6份，按照2.2項下的方法進行測定。測得茶多酚的平均含量為131.5 mg/g，RSD=1.34%（n=6），表明本方法的重復性良好。

取靈芝紅茶（批號：020150922）樣品6份，按照2.3項下的方法進行測定。測得多糖平均含量為25.71 mg/g，RSD=1.58%（n=6），表明本方法的重復性良好。

2.4.4 加樣回收試驗

取靈芝紅茶（批號：020150922）樣品0.1 g 9份，3個一組，分別加入茶多酚含量80%、100%、120%的沒食子酸對照品，按照2.2項下的方法進行測定。結(jié)果見表1。計算平均回收率為99.6%，RSD=2.52%（n=9）。

取靈芝紅茶（批號：020150922）樣品0.25 g 9份，3個一組，按照2.3.1項下的方法進行制備，再分別加入多糖含量80%、100%、120%的葡萄糖對照品，按照

2.3.3項下的方法進行測定。結(jié)果見表1。平均回收率為100.5%，RSD=1.08%（n=9）。

表1 茶多酚和多糖的加樣回收試驗Table 1 Recoveries of the tea polyphenols and total polysaccharides

2.5 樣品測定

取靈芝紅茶樣品按照2.2項下的方法進行測定，每個樣品平行3份。使用外標法計算茶多酚的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同批次靈芝紅茶中茶多酚和多糖的含量Table 2 The content of tea polyphenols and polysaccharides in different batches Ganoderma lucidum black tea

取靈芝紅茶樣品按照2.3項下的方法進行測定，每個樣品平行3份。使用外標法計算總多糖的含量，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

本試驗應用DPPH自由基、ABTS+自由基和FRAP鐵離子還原能力對靈芝紅茶的抗氧化性進行測定，以維生素C（VC）為陽性對照。通過測定靈芝紅茶對DPPH自由基的清除能力、ABTS+自由基清除能力、FRAP鐵離子還原能力來表征其抗氧化能力。結(jié)果顯示：VC對DPPH自由基和ABTS+自由基半數(shù)抑制濃度分別為11.98、11.18 μg/mL，靈芝紅茶的DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率分別為91.78%、95.87%，分別相當于26.22、23.05 μg/mL VC；靈芝紅茶的FRAP值為638，相當于7.48 μg/mL VC。表明靈芝紅茶有較強的抗氧化能力，從而證實了靈芝紅茶是具有較好抗氧化作用的保健品。

采用紫外吸光光度法建立了靈芝紅茶中的茶多酚和多糖含量測定方法，在該方法中，沒食子酸濃度在4.08 μg/mL～16.50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，平均回收率分別為99.6%（RSD=2.52%，n=9）；葡萄糖濃度在40.33 μg/mL～181.50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為100.5%（RSD=1.08%，n=9）。所建立的靈芝紅茶中茶多酚和多糖的含量測定方法簡便快捷，線性、重復性、精密度和回收率良好。并采用所建立的方法對不同生產(chǎn)批次靈芝紅茶中茶多酚和多糖的含量進行了測定。綜上所述，所建立的靈芝紅茶中茶多酚和多糖的含量測定方法操作簡便，快速，適合用于靈芝紅茶的質(zhì)量控制和產(chǎn)品生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測。

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Research on the Content of Antioxidant Active Ingredient in Ganoderma lucidum Black Tea

LIU Liang-qin1，2，3，GONG Xiao-jian1，2，3，ZHOU Xin1，2，3，*，ZHAO Chao1，2，3，CHEN Hua-guo1，2，3
（1.Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Laboratory for Quality Control&Evaluation Technology of Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China；3.The Research Center for Quality Control of Natural Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China）

Antioxidant activity of Ganoderma lucidum black tea had been studied by the experiment in vitro，included DPPH free radical，ABTS+free radical，F(xiàn)RAP.And the method was abtained that determination the content of tea polyphenols and Ganoderma lucidum polysaccharide in Ganoderma lucidum black tea with ultraviolet absorption spectrometry.In conclusion，Ganoderma lucidum black tea exhibited promising antioxidant activity.Gallicacidandglucosehadexcellentlinearitywithintheconcentrationrangein4.08 μg/mL-16.50μg/mL，40.33 μg/mL-181.50 μg/mL respectively under this method，the average recoveries were as follows：99.6%（RSD=2.52%，n=9），100.5%（RSD=1.08%，n=9）.The methods had the advantage of quick and simple，feasible，and linearity，repeatability，precision and recovery.This method could be used to determine the content of tea polyphenol and polysaccharide in Ganoderma lucidum black tea.

Ganoderma lucidum black tea；tea polyphenols；polysaccharides；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.029

2016-09-23

貴州師范大學研究生創(chuàng)新項目基金（研創(chuàng)2015021號）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目（黔科合中藥字[2013]5001號）；貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項目（黔科合人才（2015）4033號）

劉良琴（1991—），女（漢），在讀碩士，研究方向：藥用植物開發(fā)與利用。

*通信作者：周欣，女，教授，博士生導師。