楊青++張莉++張華山++熊海容

摘要：基于定向改造的木聚糖酶（DSB）和甘露聚糖酶（ManA），通過不同的整合位點和抗性標(biāo)記實現(xiàn)這兩種酶在同一宿主GS115中的整合與篩選，獲得了共表達菌株GS115/DSB-ManA。其熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明，該共表達菌株產(chǎn)出的DSB與ManA均有較高的熱穩(wěn)定性。重組菌株兩種酶的成功表達為復(fù)合酶制劑的研究和生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木聚糖酶（DSB）；甘露聚糖酶ManA；畢赤酵母（Pichia pastoris）；共表達

中圖分類號：Q19 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1971-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.043

Co-expression of Two Hemicellulases in Pichia pastoris

YANG Qing1，ZHANG Li1，ZHANG Hua-shan2，XIONG Hai-rong1

（1.College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan430074，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract：Based on the directional modification of xylanase（DSB） and mannan（ManA） synthase genes in our laboratory，the co-expression of these two hemicellulases was successfully achieved in a Pichia cell by different integration sites and resistance markers. And the recombinant strain GS115/DSB-ManA was obtained. The thermal stability test showed that the DSB and ManA produced by the co-expressed strain had high thermal stability. The successful expression of the two enzymes of the recombinant strain laid a foundation for the research and production of the complex enzyme preparation.

Key words：xylanase （DSB）； mannanase （ManA）； Pichia pastoris； co-expression

β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）均屬于半纖維素酶，分別水解半纖維素中的β-1，4-木糖苷鍵和β-1，4-甘露糖苷鍵。木聚糖為半纖維素中最豐富的一類[1]，在木聚糖酶的作用下可被降解為國際市場上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作為半纖維素第二大組分[2]，廣泛存在于木材以及植物的塊莖和種子中。

隨著對半纖維素酶的深入研究，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷的擴展，并擁有一個廣泛的工業(yè)酶應(yīng)用市場，包括食品和飼料、咖啡萃取、生物乙醇生產(chǎn)、殺黏菌劑、制藥、紡織、洗滌、造紙、石油、天然氣工業(yè)及生物技術(shù)等領(lǐng)域[3，4]。工業(yè)生產(chǎn)中，不僅需要高活力的酶，還需要酶在酸性環(huán)境、堿性環(huán)境或高溫條件下保持穩(wěn)定的酶學(xué)特性[5]，同時也希望減低生產(chǎn)成本而提高效益。本試驗研究了木聚糖酶與甘露聚糖酶的共表達，實現(xiàn)了這兩種酶在畢赤酵母中的穩(wěn)定共表達，使工業(yè)生產(chǎn)中有效地減少生產(chǎn)成本及相關(guān)處理環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌Top10細胞、表達載體pAO815hr為中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保藏與構(gòu)建。畢赤酵母GS115和表達載體pPICZαA為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所惠贈。

1.1.2 工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶等工具酶和DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；燕麥木聚糖和角豆膠購自Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract購自于Oxoid公司；無氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar購自Biosharp公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基和抗生素 畢赤酵母抗性選擇平板YPDSZ（含終濃度100 μg/mL Zeocin），畢赤酵母組氨酸缺陷型選擇平板MD，畢赤酵母生長/誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY/BMMY，大腸桿菌生長培養(yǎng)基LB/LBL，畢赤酵母生長培養(yǎng)基YPD等培養(yǎng)基配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。氨芐青霉素（Ampicillin Sodium Salt）購自Biosharp公司；博來霉素（Zeocin）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶DSB與甘露聚糖酶ManA重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選 采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切木聚糖酶DSB基因和表達載體pAO815hr，連接后轉(zhuǎn)化，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上；同樣用EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切甘露聚糖酶ManA基因和表達載體pPICZαA，連接后轉(zhuǎn)化，涂布于含有博來霉素的LB固體平板上。菌落PCR驗證后雙酶切鑒定篩選出陽性克隆菌株DSB-pAO815hr-Top10和ManA-pPICZαA-Top10。

1.2.2 木聚糖酶與甘露聚糖酶共表達重組菌的構(gòu)建及篩選

1）GS115/pAO815hr-DSB重組菌的構(gòu)建及篩選。采用SalⅠ線性化重組質(zhì)粒DSB-pAO815hr，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，挑取100個該共表達重組菌的單菌落使用BMGY/BMMY誘導(dǎo)產(chǎn)酶，使用DNS法[6]檢測酶活力，依據(jù)酶活力高低篩選出酶活力較高的重組菌株GS115/pAO815hr-DSB。

2）共表達重組菌GS115/DSB-ManA的構(gòu)建及篩選。采用SacⅠ線性化重組質(zhì)粒ManA-pPICZαA，電擊轉(zhuǎn)化GS115/pAO815hr-DSB感受態(tài)細胞[7]，按上述方法篩選出共表達重組菌株GS115/DSB-ManA。

1.2.3 GS115/DSB-ManA產(chǎn)甘露聚糖酶與木聚糖酶熱穩(wěn)定性的檢測 將發(fā)酵上清液在不同溫度下準(zhǔn)確處理30 min，迅速置于冰上冷卻，分別在DSB最適溫度（75 ℃）與 pH（6.5）下與木聚糖底物反應(yīng)和在ManA最適溫度（75 ℃）與 pH（6.0）下與角豆膠底物反應(yīng)，使用分光光度計檢測OD540 nm，以每種酶最高酶活力為100%，計算各酶在其他溫度處理后的相對殘余酶活力，每組試驗均重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.4 SDS-PAGE電泳 發(fā)酵結(jié)束后，取GS115/DSB-ManA與兩種酶單一表達菌株的上清液進行SDS-PAGE電泳分析，具體操作方法參考《分子克隆實驗指南》第二版。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶（DSB）與甘露聚糖酶（ManA）重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將DSB基因片段連接到pAO815hr上，獲得表達質(zhì)粒pAO815hr-DSB；將ManA基因片段連接到pPICZαA上，獲得表達質(zhì)粒pPICZαA-ManA，物理圖譜如圖1所示，雙酶切驗證以上重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 熱穩(wěn)定性分析

如圖2所示，GS115/DSB-ManA中木聚糖酶在45～70 ℃下處理30 min能夠保持85%以上相對酶活力，但經(jīng)過70 ℃以上溫度處理后，相對酶活力降低較為明顯；甘露聚糖酶在45～75 ℃下處理30 min后仍能保持90%以上相對酶活力，但經(jīng)過75 ℃以上溫度處理后，相對酶活力降低較為顯著。

2.3 SDS-PAGE分析

結(jié)果（圖3）表明，GS115/DSB-ManA發(fā)酵上清液中出現(xiàn)兩條電泳條帶，分別與單一表達DSB和ManA發(fā)酵上清液對比。GS115/DSB-ManA能夠同時表達出兩種半纖維素酶蛋白，且產(chǎn)物雜、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-ManA分泌木聚糖酶蛋白較分泌甘露聚糖酶蛋白量高。

3 討論

目前木聚糖酶與甘露聚糖酶已成功應(yīng)用于工業(yè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的諸多領(lǐng)域，且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶聯(lián)合使用從而達到協(xié)同增效。pPIC9K和 pPICZαA質(zhì)粒同屬于畢赤酵母分泌型表達質(zhì)粒，本試驗通過不同的整合位點和抗性標(biāo)記實現(xiàn)了DSB和ManA在同一宿主中的整合與篩選，成功構(gòu)建了共表達菌株GS115/DSB-ManA，實現(xiàn)了目標(biāo)酶的共同生產(chǎn)，同時檢測出其分泌的兩種半纖維素酶有較高的熱穩(wěn)定性，為進一步工業(yè)化生產(chǎn)復(fù)合酶奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 付 正，張華山，曾小英，等.嗜熱真菌木聚糖酶1YNA的表達和定點突變[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（7）：1487-1493.

[2] SCHELLER H V，ULVSKOV P. Hemicelluloses[J].Annual Review of Plant Biology，2010，61：263-289.

[3] SITTIKIJYOTHIN W，TORRES D，GON？覶ALVES M P.Modelling the rheological behaviour of galactomannan aqueous solutions[J].Carbohydrate Polymers，2005，59（3）：339-350.

[4] PRAKRAM S C，NEENA P，PRINCE S，et al. Mannanases： Microbial sources， production， properties and potential biotechnological applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology 2012，93：1817-1830.

[5] 張建新，趙丹丹，劉起麗，等.產(chǎn)β-甘露聚糖酶內(nèi)生菌的篩選及酶學(xué)特性分析[J].微生物學(xué)通報，2011，38（8）：1172-1178.

[6] 余紅英，孫遠明，王煒軍，等.枯草芽孢桿菌SA-22 β-甘露聚糖酶的純化及其特性[J].生物工程學(xué)報，2003，19（3）：327-331.

[7] WANG Y W，SHI P J，LUO H Y，et al. Over-expression and characterization of an alkali-tolerant endo-β-1，4-mannanase from Penicilliumfreii F63[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113（6）：710-714.