李東昊，姜 玲，阮 穎

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為觀察

李東昊，姜 玲，阮 穎

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

以甘藍(lán)型油菜“湘油15號(hào)”為材料，采用改良的卡寶品紅染色液對(duì)其進(jìn)行花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的細(xì)胞學(xué)觀察。結(jié)果表明：當(dāng)甘藍(lán)型油菜花蕾長(zhǎng)度小于1.5 mm時(shí)，花粉母細(xì)胞大多處于減數(shù)分裂時(shí)期；而花蕾長(zhǎng)度介于1.5～2.5 mm時(shí)，花粉母細(xì)胞大多已發(fā)育為單核花粉粒；相較于堿性品紅和Gimesa染色液，改良的卡寶品紅染色液著色效果更佳，核質(zhì)區(qū)分明顯；甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞在經(jīng)歷減數(shù)分裂Ⅰ和減數(shù)分裂Ⅱ后形成四分體，期間存在兩次胞質(zhì)分裂。

甘藍(lán)型油菜；花粉母細(xì)胞；減數(shù)分裂

減數(shù)分裂是有性生殖的個(gè)體形成雌雄配子的一種特殊分裂方式[1]，對(duì)遺傳變異、生物進(jìn)化等有著重要的生物學(xué)意義[2-3]。同時(shí)，它也是單倍體、多倍體遺傳育種[4-5]以及輻射誘變育種和敗育性研究[6]的理論基礎(chǔ)。

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）系十字花科蕓薹屬植物，是由二倍體的白菜型油菜（Brassia campestris L.）和甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）自然雜交而成的異源四倍體[7]，在長(zhǎng)江中下游流域廣為栽培，是非常重要的油料作物[8-9]。油菜減數(shù)分裂過程中雌雄配子發(fā)育的正常與否直接關(guān)系到產(chǎn)量的高低[10]。因此，筆者通過改良的卡寶品紅染色法對(duì)甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程進(jìn)行了較為完整的細(xì)胞學(xué)觀察，以期為研究甘藍(lán)型油菜減數(shù)分裂過程中染色體上組蛋白甲基化修飾的變化情況打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甘藍(lán)型油菜品種為“湘油15號(hào)”，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花蕾長(zhǎng)度與小孢子母細(xì)胞發(fā)育情況觀察 油菜現(xiàn)蕾后，分別選取花蕾長(zhǎng)7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0和小于1.0 mm的花進(jìn)行染色和細(xì)胞學(xué)觀察。

1.2.2 改良品紅染色液制備 首先，制備原液A，將3 g堿性品紅溶于100 mL 70%酒精。然后，取原液A 10 mL加入到90 mL 5%石炭酸水溶液中制成原液B。接著，取原液B 55 mL，加入6 mL冰醋酸和6 mL福爾馬林（38%的甲醛）制成原液C。染色液工作液配制：取原液C 10 mL，加入80 mL 45%冰醋酸，再加入1.8 g山梨醇配成10%濃度的卡寶品紅染色液，靜置14 d，備用。

1.2.3 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的觀察 油菜現(xiàn)蕾開花后，采集處于不同發(fā)育時(shí)期的花蕾；將采集的材料用卡諾固定液（酒精︰冰醋酸=3︰1）固定24 h，使用1 mol/L鹽酸60℃解離5 min；分別用Gimesa染色液、傳統(tǒng)的堿性品紅染色液和改良的卡寶品紅染色液進(jìn)行染色（30 min），在顯微鏡下觀察并拍攝，比較3種染色液的著色效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾長(zhǎng)度與雄配子體發(fā)育時(shí)期的關(guān)系

從圖1中可以看出，當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為1.5～2.5 mm時(shí)，約80%的花粉母細(xì)胞已發(fā)育為單胞花粉粒；而花蕾小于1.5 mm時(shí)，85%的花粉母細(xì)胞正處于減數(shù)分裂時(shí)期。因此，試驗(yàn)選取花蕾小于1.5 mm的花粉母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察。

圖1 3種不同染色液不同長(zhǎng)度的花蕾

2.2 3種不同染色液著色效果的比較

如圖2所示，Gimesa染色液著色不明顯，而傳統(tǒng)的堿性品紅染色液，盡管其著色較深，可以很好地觀察到染色質(zhì)位置，但是缺點(diǎn)也很明顯，即在一些時(shí)期，不能很好地區(qū)分染色體狀態(tài)；相較于前兩者，改良后的卡寶品紅染色液可以較好地著色，以便清晰地觀察花粉粒形態(tài)和染色體行為。

2.3 甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程觀察

對(duì)小于1.5 mm的花蕾進(jìn)行染色和顯微觀察發(fā)現(xiàn)，跟大多數(shù)植物一樣，甘藍(lán)型油菜“湘油15號(hào)”的花粉母細(xì)胞歷經(jīng)了分裂間期、減數(shù)分裂Ⅰ、減數(shù)分裂Ⅱ以及2次胞質(zhì)分裂后，最終形成四分體。

圖2 3種不同染色液著色效果的比較

花粉母細(xì)胞首先進(jìn)入減數(shù)分裂間期，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)多為近似圓形。進(jìn)入減Ⅰ前期：細(xì)胞核開始消失，染色質(zhì)加深濃縮形成染色體，此時(shí)可以較為清楚地看到聯(lián)會(huì)的同源染色體（圖3A）。減Ⅰ中期：細(xì)胞核膜與核仁消失，紡錘體出現(xiàn)，染色體集中出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中間的赤道板上，此時(shí)染色體排布有重疊現(xiàn)象不利于染色體的觀察（圖3B）。減Ⅰ后期：核內(nèi)同源染色體由紡錘絲牽引，各自移向兩極，此時(shí)可以觀察到核內(nèi)兩側(cè)有染色體的聚集（圖3C）。減Ⅰ末期：染色體解壓縮，染色質(zhì)逐漸向中間聚集，細(xì)胞質(zhì)分裂1次，形成2個(gè)大小均等的細(xì)胞質(zhì)（圖3D）。二分體時(shí)期：減數(shù)第一次分裂后，核內(nèi)染色質(zhì)不進(jìn)行復(fù)制，經(jīng)短暫的間期后，分裂在2個(gè)子細(xì)胞的染色質(zhì)再次濃縮形成染色體（圖3E）。減Ⅱ中期：各姐妹染色單體向細(xì)胞中部聚集，排布于赤道板上（圖3F）。減Ⅱ后期：姐妹染色單體由紡錘體牽引向兩側(cè)聚集（圖3G）。四分體時(shí)期：兩側(cè)聚集的染色體再次解濃縮，核膜核仁出現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行第二次分裂，小孢子細(xì)胞質(zhì)外形成胼胝質(zhì)共同包圍形成四分體，至此減數(shù)分裂完成（圖3H）。

此后小孢子進(jìn)一步發(fā)育直至形成具有細(xì)胞外壁的單核花粉粒。游離狀態(tài)下的單核花粉粒，形狀近似橢圓，細(xì)胞核大且集中，胞質(zhì)濃厚，未觀察到明顯的液泡。

3 討 論

甘藍(lán)型油菜，尤其是在自然界穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜[11]。在新合成的雙二倍體中，穩(wěn)定的染色體配對(duì)通常是由遺傳控制（例如小麥、燕麥）的，或者是由染色體結(jié)構(gòu)改變而獲得的（如棉花）[12-15]。盡管堿性品紅染色液染色效果出眾，但是對(duì)染色體與細(xì)胞質(zhì)的區(qū)分效果較差。而改良后的卡寶品紅染色液能有效地解決這一問題，使染色體著色明顯強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)，在觀察時(shí)很容易將兩者區(qū)分開來。

表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是不同于傳統(tǒng)遺傳學(xué)的一個(gè)學(xué)科分支，其研究的主要內(nèi)容是由非基因序列改變而引起的，在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中可以穩(wěn)定傳遞的基因或者蛋白表達(dá)的變化[16-17]。染色體上組蛋白發(fā)生的共價(jià)化學(xué)修飾（甲基化，乙?；龋┮矊儆诒碛^遺傳學(xué)的范疇[18]。因此，觀察花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂行為，有助于開展甘藍(lán)型油菜的表觀遺傳學(xué)研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在減數(shù)分裂Ⅰ和Ⅱ的前期、中期和后期可以很好地觀察到染色體的分布情況，為研究甘藍(lán)型油菜染色體上組蛋白甲基化修飾的變化情況打下了基礎(chǔ)。

圖3 “湘油15號(hào)”花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程

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（責(zé)任編輯：成 平）

ObservationofPollenMotherCellMeiosisinBrassica napus

LI Dong-hao，JIANG Ling，RUAN Ying
（College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

The cytoplasmic observation of pollen mother cell meiosis in Brassica napus Xiangyou 15 was carried out with the modified carbol fuchsin. The results indicated that when the length of buds is less than 1.5 mm, pollen mother cells mostly are in the meiosis period; and while the length of buds are between 1.5 mm and 2.5 mm, pollen mother cells mostly develop into mononuclear pollen grains. Compared with alkaline fuchsin and Gimesa, the modified carbol fuchusin is effective in pigmentation, with clear nucleus-cytoplasm distinction. And after the meiosisⅠand meiosisⅡ, pollen mother cells of Brassica napus develop into tetrads, along with cytokinesis twice.

Brassica napus; polen mother cell; meiosis

Q942.4

A

1006-060X（2017）05-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.005.001

2017-03-05

作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)基金開放項(xiàng)目（12KFXM10）

李東昊（1992-），男，湖南長(zhǎng)沙市人，碩士研究生，專業(yè)方向：植物發(fā)育與表觀遺傳。

阮 穎