王 建， 辛 良， 武沛澤， 王宏鈞， 范慶增,， 薛寶君， 溫會文， 劉福林， 范 開， 常建宇

(1.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司 ， 天津西青300380 ； 2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京海淀100193)

恩諾沙星對肉仔雞脛骨關節(jié)軟骨的影響

王 建1， 辛 良2， 武沛澤2， 王宏鈞2， 范慶增1,2， 薛寶君1， 溫會文2， 劉福林2， 范 開2， 常建宇2

(1.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司 ， 天津西青300380 ； 2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京海淀100193)

為了探究氟喹諾酮類藥物恩諾沙星對禽類脛骨發(fā)育的影響，以恩諾沙星為研究對象，選取雄性肉雞雞雛，隨機分成5組，分別為空白組、10 mg/kg體重組、30 mg/kg體重組、60 mg/kg體重組、100 mg/kg體重組，每組36只，于1日齡和7日齡進行相應的給藥處理，在7、14、21、28、35、42 d每組隨機抽取6只肉雞，取部分脛骨關節(jié)軟骨做組織切片用，觀察脛骨關節(jié)軟骨組織結構變化并記錄關節(jié)軟骨細胞數量，評價脛骨關節(jié)軟骨的發(fā)育情況。結果表明，恩諾沙星對肉雞脛骨關節(jié)軟骨的組織結構影響不顯著，靜止區(qū)軟骨細胞和肥大區(qū)軟骨細胞在不同生長時期時，不同劑量恩諾沙星對其細胞數量影響差異不顯著。

恩諾沙星 ； 肉仔雞 ； 關節(jié)軟骨毒性

喹諾酮類藥物是指一類具有4-喹諾酮環(huán)結構的藥物，在臨床治療中已成為很多感染性疾病的首選藥物，使用頻率僅次于青霉素類[1]。喹諾酮類藥物同其他抗生素一樣，也存在藥物不良反應，通常表現(xiàn)在血液系統(tǒng)反應、消化系統(tǒng)反應、中樞神經系統(tǒng)癥狀、過敏反應、肝腎臟器損害等[2]，但對幼年動物的負重關節(jié)、軟骨的損害也不容忽視。結合臨床癥狀和文獻報道，在臨床上使用喹諾酮類藥物后引起犬貓后肢癱瘓的原因，主要表現(xiàn)在此類藥物對幼年犬貓的負重關節(jié)及關節(jié)軟骨的影響；且在動物試驗中發(fā)現(xiàn)，其關節(jié)損傷的發(fā)生及損傷程度均與喹諾酮類藥物用藥劑量呈正相關[3]。Machida等觀察喹諾酮類藥物對幼年動物的毒性作用，結果發(fā)現(xiàn)兔、鼠、犬均可發(fā)生關節(jié)病變[4]。

目前對禽類的軟骨毒性尚不清楚，在肉雞養(yǎng)殖業(yè)中如果氟喹諾酮類藥物如恩諾沙星等使用是否會加大對肉雞脛骨軟骨發(fā)育的影響尚不清楚。本試驗擬采用肉雞養(yǎng)殖中的恩諾沙星給藥規(guī)程，通過加大恩諾沙星的給藥劑量，探討恩諾沙星對快速生長的肉雞的生長性能以及關節(jié)軟骨的發(fā)育影響。

1 試驗材料

Leica RM2235手輪轉切片機，KD-BL包埋機冷凍臺，KD-P攤片機，KD-BM生物組織包埋機，QB-2000烘片機，YLE-1000電熱恒溫水浴鍋，CX21倒置式研究型顯微鏡，Harris蘇木素染液，伊紅染液，切片石蠟，環(huán)保透明劑Van-Clear，GS封片膠，10×PBS緩沖液

2 試驗步驟

2.1 本試驗采取單因子隨機試驗設計，將5組的雛雞按照下表對應的給藥劑量進行給藥。其中肌肉注射的低(A)、中(B)、高(C)、超高(D)劑量組分別于1日齡和7日齡按相應劑量肌肉注射給藥1次，空白對照組于1日齡和7日齡肌肉注射生理鹽水1次，每次0.5 mL/只。

表1 分組設計

注：肌肉注射的部位是雛雞的左腿

2.2 每組分別在第7、14、21、28、35、42天隨機抓取6只，分離雞只左側脛骨，生理鹽水清洗，用刀片取小塊軟骨組織浸泡在10%福爾馬林溶液中，進行脫鈣處理。

2.3 制作脛骨軟骨組織切片，并進行H.E.染色。

2.4 軟骨細胞數量統(tǒng)計：每組6個切片中分別在10倍物鏡下觀測切片并拍照，每張切片選取相應靜止區(qū)與肥大區(qū)，于40倍物鏡下拍照，攝片結果經Image Pro Plus軟件下統(tǒng)計各圖中軟骨細胞數量，以劑量組為單位，求各組平均值。

3 試驗結果

3.1 不同劑量恩諾沙星對肉仔雞脛骨關節(jié)軟骨靜止區(qū)軟骨細胞數的影響 不同劑量恩諾沙星第1周時對肉仔雞脛骨軟骨靜止區(qū)軟骨細胞的數量影響組間差異不顯著(P<0.05)；第2周時，不同劑量恩諾星對肉仔雞脛骨軟骨靜止區(qū)軟骨細胞數量影響差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重組比30 mg/kg體重、60 mg/kg體重、100 mg/kg體重和空白組分別高8.12%、11.46%、15.25%、11.89%，10 mg/kg體重組靜止區(qū)軟骨細胞數量顯著高于100 mg/kg體重組(P<0.05)，與其余組差異不顯著(P>0.05)，不同劑量組呈現(xiàn)出隨著劑量升高細胞數量下降的趨勢；第3周時，30 mg/kg體重組比100 mg/kg體重組高14.35%，差異顯著(P<0.05)，其余各組差異不顯著，不同劑量組之間呈現(xiàn)出隨著劑量上升細胞數量先上升后下降的趨勢；第4周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉仔雞脛骨軟骨靜止區(qū)軟骨細胞數量的影響差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重、30 mg/kg體重組與60 mg/kg體重、100 mg/kg體重組相比，差異顯著(P<0.05)，不同劑量組間呈現(xiàn)出隨著劑量的增加細胞數量先升高后降低的趨勢；第5周時，不同劑量組恩諾沙星對肉仔雞脛骨軟骨靜止區(qū)細胞數量影響顯著，60 mg/kg體重組比10 mg/kg體重、30 mg/kg體重、100 mg/kg體重，空白組分別低8.12%、7.43%、6.69%、12.1%，差異顯著(P<0.05),組間差異顯著性水平下降；第6周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉仔雞脛骨軟骨發(fā)育影響組間差異不顯著(P>0.05)。

3.2 不同劑量恩諾沙星對肉仔雞脛骨關節(jié)軟骨肥大區(qū)軟骨細胞數量的影響 第1周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉仔雞脛骨軟骨肥大區(qū)細胞數量影響差異顯著(P<0.05)，30 mg/kg體重組比100 mg/kg體重組軟骨細胞數量高14.8%，差異顯著(P<0.05)，其余各組與100 mg/kg體重、30 mg/kg體重組差異不顯著(P>0.05)，細胞數量位于兩者之間；第2周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉仔雞脛骨軟骨肥大區(qū)細胞數量的影響組間差異顯著(P<0.05)，100 mg/kg體重組比10 mg/kg體重、30 mg/kg體重及空白組軟骨細胞數量低，分別為8.14%、10.39%，相比差異顯著(P<0.05)；第3周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉仔雞脛骨軟骨肥大區(qū)細胞數量影響組間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重、30 mg/kg體重與空白組比100 mg/kg體重組分別高8.16%、7.45%、10.56%，相比差異顯著(P<0.05)；第4周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉仔雞脛骨軟骨細胞數量的影響組間差異顯著(P<0.05)，60 mg/kg體重、100 mg/kg體重比空白組脛骨軟骨細胞數量低8.09%、8.12%，相比差異顯著(P<0.05)；第5周與第6周時，不同劑量恩諾沙星對肉仔雞脛骨軟骨肥大區(qū)軟骨細胞數量的影響組間差異均不顯著(P>0.05)。

3.3 H.E.染色觀察不同劑量恩諾沙星對肉仔雞脛骨軟骨的組織結構的影響 雞脛骨關節(jié)軟骨組織切片H.E.染色結果表明，在不同生長時期中的空白對照組關節(jié)軟骨都表現(xiàn)為軟骨表面光滑，關節(jié)軟骨細胞排列正常，層次分明，結構清楚，基質正常，軟骨膜結構完整，靜止區(qū)同源軟骨細胞均勻分布，軟骨囊明顯，著色較深；增殖區(qū)軟骨細胞密集，與靜止區(qū)及前肥大區(qū)界限明顯，細胞呈長梭形，垂直于脛骨長軸，前肥大區(qū)軟骨細胞大量分化為肥大區(qū)軟骨細胞，細胞形態(tài)由長梭形逐漸轉變成為圓形，同時細胞體積變大，細胞胞漿豐富，鈣化區(qū)肥大軟骨細胞正常鈣化，骨小梁周圍少見未完全鈣化的軟骨細胞。

在不同生長時期的肉雞脛骨關節(jié)軟骨組織結構與空白對照組肉雞脛骨關節(jié)軟骨組織結構并無明顯的區(qū)別，表現(xiàn)為軟骨表面比較光滑，關節(jié)軟骨細胞排列較正常，層次較清楚，在60 mg/kg體重組以及100 mg/kg體重組有時可見軟骨膜增厚，基質著色在高劑量時可見基質著色輕微變淡，軟骨膜結構完整，靜止區(qū)同源軟骨細胞分布較均勻且細胞數量存在如3.1中所描述的變化情況，軟骨囊較明顯，著色深；增殖區(qū)軟骨細胞密集，與靜止區(qū)及前肥大區(qū)界限相比空白對照組略有不明顯，細胞呈長梭形，垂直于脛骨長軸，前肥大區(qū)軟骨細胞大量分化為肥大區(qū)軟骨細胞，細胞數量存在如3.2中所描述變化情況，細胞形態(tài)由長梭形逐漸轉變成為圓形，同時細胞體積變大，細胞胞漿豐富，鈣化區(qū)肥大軟骨細胞數量較多，骨小梁周圍可見一定數量未完全鈣化的肥大軟骨細胞。

4 討論

氟喹諾酮類藥物的軟骨毒已經在諸多哺乳動物的藥物試驗中得到證實，試驗證明氟喹諾酮類藥物具有軟骨毒性，而且動物年齡越小，毒性越明顯，越嚴重。氟喹諾酮類藥物的軟骨毒性作用機理尚不清楚，但有比較流行的幾個假說。Stahlmannr等[5]認為，氟喹諾酮類因其化學結構中鎂離子的螯合性從而影響了局部鎂離子的濃度，進而影響了軟骨細胞表面B1整合素的正常功能，引起軟骨細胞的損傷，而幼齡動物處在骨生長期，需要大量鎂離子的參與軟骨的增殖和分化，近些年研究也表明了氟喹諾酮的使用與低鎂攝入對軟骨的損傷具有協(xié)同的作用[5-7]。也有研究表明，氟喹諾酮類藥物引起軟骨損傷的分子機制可能與軟骨細胞內活性氧(H2O2)的增加有關，過量生成的H2O2使細胞外的基質成分如膠原、透明質酸酶的結構被破壞[8]，從而誘發(fā)軟骨損傷。

對相同動物的不同軟骨存在差別，通過文獻我們可以知道，對不同軟骨的毒性存在以下規(guī)律：膝關節(jié)軟骨>髖關節(jié)軟骨>腕關節(jié)軟骨，是由于不同關節(jié)軟骨的負荷不同而導致的，來自于后天的關節(jié)活動頻率和受力大小，而并非是氟喹諾酮類藥物對不同關節(jié)軟骨的毒性作用不同，對不同動物相對部位軟骨的軟骨毒性存在差別，具有以下的規(guī)律：犬>大鼠>兔>豬>猴[9]，可能與生長速度和受力大小和關節(jié)活動頻率綜合相關，而人的關節(jié)軟骨毒性并沒有犬等哺乳動物明顯，可能是因為相對于犬、豬等哺乳動物，人的生長速度明顯更慢，而且人在用藥時用量更精確也更謹慎。

在本試驗設計時，由于肉雞屬于禽類，氟喹諾酮類藥物具有種屬特異性，并無相關的文獻證明禽的軟骨毒性。對于肉雞，它具有生長速度快的特點，42 d便可以出欄，從負荷角度以及生長速度來講，禽類的軟骨毒性應該容易顯現(xiàn)，同時我們選擇敏感性最強的關節(jié)軟骨作為組織結構變化的觀測對象，具有放大效果。但肉雞活動性小，多靜臥，關節(jié)活動少，受力也因此減少。兩方面綜合來看，肉雞關節(jié)軟骨毒性的顯現(xiàn)并未可知。從本次試驗結果得知，10～100 mg/kg體重恩諾沙星正常給藥對肉雞脛骨關節(jié)軟骨的組織結構至出欄時影響不顯著。

[1] 李文平,李志萬.喹諾酮類藥物的發(fā)展現(xiàn)狀[J].中國獸醫(yī)雜志，2002,36(9):37-39.

[2] 張安和.喹諾酮類抗菌藥分類及主要不良反應[J].醫(yī)藥導報，1999, 18(6):450.

[3] Stahlmann R,Blankenburg G,Neuberf D. Studi-es on cartilage formationand differentiation in limb-Bud culture in the presence of NA OFLX and CPLX[J].Rev Infect Dis,1988,10(SupplⅠ):147.

[4] Machida M,Kusajima H,Aijima H,etal.Toxicokinetic study of norfloxacin-induced arthropathy in juvenile animals[J].Toxicol Appl Pharmacol，1990,105:403-412.

[5] Egerbacher M, Edinger J, Tschulenk W. Effects of enrofloxacin and ciprofloxacin hydrochloride on canine and equine chondrocytes in culture[J]. Am J Vet Res，2001, 62(5): 704-708.

[6] Burkhardt J E, Walterspiel J N, Schaad U B. Quinolone arthropathy in animals versus children[J]. Clin Infect Dis，1997, 25(5): 1196-1204.

[7] Lozo E, Riecke K, Schwabe R,etal. Synergistic effect of ofloxacin and magnesium deficiency on joint cartilage in immature rats[J]. Antimicrob Agents Chemother，2002, 46(6): 1755-1759.

[8] 曲芬，姜素椿，李瑞霞，等. 孕婦血漿,羊水及胎兒血漿,軟骨中環(huán)丙沙星濃度的測定[J]. 中國抗生素雜志，1998， 153-155.

[9] 盛治國，李芊芊，彭雙清. 喹諾酮類抗菌藥物的軟骨毒性及作用機制的研究進展[J]. 中國藥學雜志，2007(10): 723-725.

2016-08-09

王建(1970-)，男，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事獸藥的研發(fā)、生產及銷售管理工作，E-mail：wangjian5555@163.com

范開，E-mail：dirtyfan@sina.com；常建宇，E-mail：changjianyu@cau.edu.cn

S859.79+6

B

0529-6005(2017)05-0104-03