戴瑜來(lái)，許寶青，張 樂(lè)，林啟存，戴楊鑫，馬恒甲，蔡麗娟，朱麗敏

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

水產(chǎn)用阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝

戴瑜來(lái)，許寶青，張 樂(lè)，林啟存，戴楊鑫，馬恒甲，蔡麗娟，朱麗敏

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

為了優(yōu)化阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝，形成契合水產(chǎn)養(yǎng)殖需求的微球制備工藝。采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備微球，以微球粒徑和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)微球在養(yǎng)殖水體中的釋放情況進(jìn)行了考察。結(jié)果所得微球外觀形態(tài)良好，粒徑在50～80 μm，包封率達(dá)72.6%，64 h藥物累計(jì)釋放率少于60%。相對(duì)于原藥在水體中4 h 100%溶出，阿維菌素聚乳酸微球具有顯著的緩釋作用。

阿維菌素； 水產(chǎn)用； 聚乳酸； 緩釋

阿維菌素(avermectin)是一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由于其作用機(jī)制獨(dú)特，用量小，驅(qū)蟲效果好，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，并取得了巨大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益[1]。

阿維菌素常規(guī)劑型有片劑、粉劑、乳劑、糊劑、透皮劑、口服液、注射液等[2]，水產(chǎn)上常用的是粉劑和乳劑。阿維菌素的常規(guī)劑型極易光分解氧化，導(dǎo)致其光穩(wěn)定性差，潑灑使用持效期短，無(wú)形中增加了漁民用藥次數(shù)和防治成本[3]。此外，常規(guī)劑型存在有效成分達(dá)峰快、峰值高和有效抗蟲濃度持續(xù)時(shí)間短等缺陷，易引起養(yǎng)殖動(dòng)物急性毒性反應(yīng)，且導(dǎo)致藥物抗蟲效果不佳。

上述問(wèn)題在較大程度上是由于常規(guī)藥物的加工劑型、使用方法和對(duì)象的不合理造成的，將現(xiàn)有藥物品種的配方及劑型進(jìn)行改進(jìn)是目前藥物研發(fā)的主要方向，相對(duì)于開發(fā)新藥物具有更好的成效和更低的成本。緩釋制劑是指用常規(guī)藥物與載體材料、輔料制成持續(xù)穩(wěn)定釋放的劑型，它可根據(jù)病害發(fā)生規(guī)律、特點(diǎn)及環(huán)境條件，使藥物按照需要的劑量、特定的時(shí)間、持續(xù)穩(wěn)定地釋放，以達(dá)到經(jīng)濟(jì)、安全、有效地控制病害。目前，在農(nóng)林牧業(yè)中使用阿維菌素緩釋制劑已有相關(guān)研究，并取得較好使用效果，但應(yīng)用于水產(chǎn)上的阿維菌素緩釋制劑卻鮮有報(bào)道。

本研究選用無(wú)污染、可降解材料聚乳酸作為輔材，通過(guò)乳化-溶劑揮發(fā)制成阿維菌素緩釋制劑，并對(duì)其形態(tài)特征、粒徑大小及養(yǎng)殖水體的釋藥情況進(jìn)行研究，旨在為阿維菌素緩釋制劑應(yīng)用于水產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Waters Alliance e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世)；FA2204B電子分析天平(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Olympus BX53顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；S-3400N型掃描電子顯微鏡(日本HITACHI)；RS-360E超聲波清洗儀(上海華巖儀器設(shè)備有限公司)；DSX電動(dòng)攪拌機(jī)(杭州儀表電機(jī)有限公司)；HS-2恒溫水浴鍋(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.2 藥物與試劑

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，純度95.0%，德國(guó)DR.Ehrenstorfer公司；阿維菌素原藥，純度98.0%，浙江盛通科技有限公司；聚乙烯醇124為優(yōu)級(jí)純，二氯甲烷、甲醇、吐溫80等為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化制備工藝，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將聚乳酸濃度(A)、聚乙烯醇濃度(B)、給藥量(C)、攪拌速率(D)確定為試驗(yàn)影響因素，每個(gè)因素選1～3個(gè)水平，分別為A 2%、3%和4%，B 0.6%、0.8%和1.0%，C 0.75、1.00和1.25 g，D 300、400和500 r·min-1。根據(jù)L9(34)正交表設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)。

1.2.2 制備方法

采用O/W(油相/水相)乳化-溶劑揮發(fā)法制備。分別稱取一定量原藥阿維菌素和聚乳酸攪拌溶于二氯甲烷中組成分散相(共25 mL)；聚乙烯醇(連續(xù)相穩(wěn)定劑)加熱溶解于蒸餾水中(共250 mL)，將分散相緩慢加入到連續(xù)相中，以一定攪拌速率攪拌形成油-水乳劑，至乳滴固化形成球狀體后升高系統(tǒng)溫度到45 ℃，降低攪拌速率，直至有機(jī)溶劑揮發(fā)停止攪拌，靜置后，過(guò)濾得到固體微粒，經(jīng)蒸餾水洗滌3次，干燥后貯存?zhèn)溆肹4]。

1.3 主要性能測(cè)定

1.3.1 形態(tài)觀察

光學(xué)顯微鏡觀察。用去離子水將一定量的微球粉末配制成懸浮液后，滴于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察微球形態(tài)、粒徑大小，并選取有代表性的區(qū)域進(jìn)行拍照。

電鏡觀察。將微球首先進(jìn)行噴金處理，以掃描電子顯微鏡觀察微球的整體形態(tài)和單個(gè)微球的表面狀態(tài)。

1.3.2 質(zhì)量濃度檢測(cè)

以高效液相色譜法(HPLC)為檢測(cè)方法。色譜條件為：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。準(zhǔn)確稱取12.5 mg阿維菌素對(duì)照品至25 mL容量瓶，用甲醇溶解定容。分別吸取適量，用甲醇稀釋，制成含阿維菌素為0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取10 μL，用HPLC分析，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 載藥量和包封率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.05 g微球，用二氯甲烷溶解后，再用甲醇定容至25 mL，稀釋10倍后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定濾液中阿維菌素含量。

載藥量/%=微球中阿維菌素的質(zhì)量÷微球的總質(zhì)量×100；

包封率/%=微球中阿維菌素的質(zhì)量÷實(shí)際加入阿維菌素的質(zhì)量×100。

1.3.4 養(yǎng)殖水體中藥物溶出測(cè)定

分別稱取等量原藥和緩釋微球(以阿維菌素量計(jì))，先經(jīng)乳化劑(吐溫80)乳化后，稀釋潑灑于養(yǎng)殖水體(2 m×2 m水泥池，水體深1 m)，分別在0.5、1、2、4、8、16、32、64 h取樣(每次取1 L，取樣后加入等量養(yǎng)殖水)，裝瓶后待處理。試驗(yàn)分別設(shè)有2個(gè)平行組。

1.3.5 水樣處理

將1 L水樣用3×50 mL二氯甲烷萃取，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至1～2 mL，然后用高純氮吹干，色譜甲醇定容至5 mL后待測(cè)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高效液相色譜上機(jī)分析后，以色譜峰面積為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=1.84×104C+6.85×103，r=0.999 9。

2.2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果

由表1結(jié)果可見(jiàn)，正交設(shè)計(jì)最佳制備工藝條件是A3B2C1D2，即聚乳酸濃度為4.0%、聚乙烯醇濃度為0.8%、給藥量為0.75 g、攪拌速率為400 r·min-1；從極差大小判斷，四因素對(duì)包封率的影響程度由大到小依次為A>C>B>D。因?yàn)樽罴压に囄丛谡辉囼?yàn)表中，根據(jù)最佳工藝試驗(yàn)制備微球，并測(cè)其包封率為72.6%，載藥量達(dá)54.8%。

表1 制劑工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

試驗(yàn)編號(hào)ABCD平均包封率/%111114832122255331333420421235895223155662312609731325698321368593321541均值Ⅰ485547592527-均值Ⅱ585598561577-均值Ⅲ599513515565-極差113757750-

2.3 微球表征觀察

由圖1可看出，微球粒徑在50～80 μm，分散均勻，形態(tài)均一，球形度較好。

2.4 養(yǎng)殖水體中藥物溶出結(jié)果

由圖2可知，原藥的溶出速度最快，到試驗(yàn)4 h已經(jīng)完全溶出，而各組微球均具有良好的緩釋性能，到試驗(yàn)結(jié)束(64 h)釋放均不超過(guò)60%的藥量；最優(yōu)制備條件下制得的微球緩釋效果除略小于試驗(yàn)組6外，均好于其他試驗(yàn)組。圖中顯示，阿維菌素微球均存在突釋和緩釋2個(gè)階段，前1 h表現(xiàn)出突釋效應(yīng)，到8 h左右處出現(xiàn)緩釋平臺(tái)。

圖1 最佳制備工藝條件下的微球

圖2 正交組、最優(yōu)工藝、原藥在養(yǎng)殖水體中的釋放曲線

3 小結(jié)與討論

制備微球的方法主要有乳化-溶劑揮發(fā)法、相分離法、乳化溶劑萃取法、噴霧干燥法、熔融法等，其中乳化溶劑揮發(fā)法最為常用[6]。該方法制備微球與藥物性質(zhì)、揮發(fā)性溶劑、乳化劑種類、攪拌速率、儀器設(shè)備、聚合物在分散中的濃度等有關(guān)[7-8]。本研究所選藥物為脂溶性藥物，在水中幾乎不溶(10 μg·L-1)，非常適用于O/W乳化-溶劑揮法制備載藥微球[9]。為了獲得最佳工藝條件，本試驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，研究了輔料濃度、投藥量、乳化劑濃度、攪拌速率對(duì)微球質(zhì)量的影響，所制得的微球形態(tài)均一、球形度好，在養(yǎng)殖水體中具有較好的緩釋效果。

突釋現(xiàn)象是藥物較難解決的問(wèn)題，突釋效應(yīng)可造成短時(shí)間內(nèi)釋放出大量的藥物，使體內(nèi)的血藥水平陡然升高，產(chǎn)生不良反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，原藥和微球的溶出過(guò)程中均存在突釋現(xiàn)象，微球藥物中的原藥雖然被輔料填充在材料內(nèi)，但仍存在突釋現(xiàn)象，其原因可能是微球表面粘附原藥或微球干燥時(shí)藥物向微球表面遷移富集引起[10]。然而，微球藥物的突釋效應(yīng)要遠(yuǎn)小于阿維菌素原藥，因此，使用微球藥物較原藥具有更高的安全性。

[1] 邢麗紅，冷凱良，翟毓秀，等. 鱸魚組織中阿維菌素、伊維菌素殘留的高效液相色譜熒光檢測(cè)法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2008，29(4)：52-57.

[2] 唐輝，陳文，姚新成，等. 緩釋阿維菌素明膠微球的研制及其體外釋放特性[J]. 中國(guó)新藥雜志，2002，11(6)：463-464.

[3] 吳傳萬(wàn)，杜小鳳，王偉中. 阿維菌素光分解及其光穩(wěn)定劑的篩選[J]. 農(nóng)藥，2006，45(12)：828-833.

[4] 王敏儒，陳杖榴，馮淇輝. 伊維菌素聚乳酸微球的研制及其體外釋藥試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，1999，29(8)：10-12.

[5] 張衛(wèi)，虞云龍，林匡飛，等. 阿維菌素在土壤中的微生物降解研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15(11)：2175-2178.

[6] 張海龍，林建強(qiáng). 乳化溶劑揮發(fā)法在微球制備中的應(yīng)用[J]. 西北藥學(xué)雜志，2007，22(2)：51-52.

[7] WATTS P J，DAVIES M C，MELIA C D. Microencapsulation using emulsification/solvent evaporation：An overview of techniques and application[J]. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7(3)：235-259.

[8] 王哲，倪宏哲，張明耀，等. 聚乳酸微球制備工藝的研究[J]. 高分子材料科學(xué)與工程，2007，23(6)：207-210.

[9] 龍娜，呂竹芳. 微球緩釋系統(tǒng)的突釋現(xiàn)象及其影響因素[J]. 中國(guó)藥師，2010，13(3)：421-423.

[10] 王愷源，高永良. 影響PLGA微球突釋的因素以及控制技術(shù)[J]. 中國(guó)新藥雜志，2011，20(6)：557-562.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-03-14

杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專項(xiàng)(20150432B10)；國(guó)家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-46)

戴瑜來(lái)(1986—)，男，浙江奉化人，工程師，從事水產(chǎn)病害防治與水域環(huán)境監(jiān)測(cè)研究工作，E-mail：dylaiuai@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170543

TS254

B

0528-9017(2017)05-0858-03

文獻(xiàn)著錄格式：戴瑜來(lái)，許寶青，張樂(lè)，等. 水產(chǎn)用阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(5)：858-860.