朱燕 黃真 鐘曉明

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杭州310053

姬松茸不同提取物對(duì)UVB致HaCaT細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用研究

朱燕 黃真 鐘曉明

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杭州310053

[目的]研究姬松茸不同提取物對(duì)中波紫外線（ultraviolet B，UVB）致人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）光損傷的保護(hù)作用。[方法]采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測(cè)定不同劑量UVB對(duì)正常HaCaT細(xì)胞存活率的影響，姬松茸不同提取物對(duì)正常HaCaT細(xì)胞存活率的影響，以及姬松茸不同提取物對(duì)UVB所致光損傷的HaCaT細(xì)胞存活率的影響。[結(jié)果]①不同劑量UVB照射后細(xì)胞存活率均下降，且呈劑量依賴性，當(dāng)UVB達(dá)20mj/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率為53.23%。②姬松茸水提物濃度在0.2～4mg·mL-1、醇提物在0.1～2mg·mL-1、粗多糖在0.2～1mg·mL-1時(shí)具有促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖的作用，醇提物和粗多糖濃度增大則抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。③姬松茸水提物濃度在1～4mg·mL-1、醇提物在1～2mg·mL-1、粗多糖在0.5～1mg·mL-1均能顯著提高20mj/cm2UVB照射后HaCaT細(xì)胞的存活率（P＜0.01）。[結(jié)論]姬松茸不同提取物可以在一定程度上減輕UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的光損傷，具有抗皮膚光老化的潛力。

姬松茸；水提物；醇提物；粗多糖；HaCaT；UVB；保護(hù)作用

近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，到達(dá)地球表面的紫外線（ultraviolet，UV）日益增多，長(zhǎng)期或過(guò)量的紫外線輻射可導(dǎo)致皮膚損傷或癌變[1-2]，紫外線輻射對(duì)健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境與健康問(wèn)題之一。有關(guān)紫外線輻射的機(jī)制和防治是目前研究的熱點(diǎn)之一。姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又名巴西蘑菇，屬擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，是一種珍稀的食藥兼用真菌[3]。姬松茸子實(shí)體富含多糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸、凝集素、甾醇、維生素和微量元素等多種化學(xué)成分。研究表明姬松茸具有較強(qiáng)的清除自由基、超氧陰離子等的體外抗氧化能力[4-6]，還具有抗輻射、抗炎、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等多種生物活性[7-8]。但目前為止尚無(wú)有關(guān)姬松茸抗UV損傷方面的研究報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)選擇人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）作為受試細(xì)胞，在體外建立中波紫外線（ultraviolet B，UVB）照射致HaCaT細(xì)胞光損傷模型，研究姬松茸不同提取物對(duì)UVB致HaCaT細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥材姬松茸，網(wǎng)上購(gòu)得，產(chǎn)于云南麗江，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為蘑菇科蘑菇屬姬松茸（Agaricus blazei Murrill）。

1.2 細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC（武漢）。

1.3 主要試劑和儀器MEM培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，15122907），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，20151228），0.25%胰酶-EDTA（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，20151111），DMSO、MTT（美國(guó)sigma，37900160、0732C226）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），SS-01B紫外線光療儀（上海SIGMA高技術(shù)有限公司），倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK）。

2 方法

2.1 姬松茸不同提取物的制備姬松茸水提物制備[9]：取姬松茸粉末10g，按1:20加蒸餾水，在85℃提取2次，每次2.5h，過(guò)濾合并濾液，回收溶劑，真空干燥，備用。姬松茸醇提物制備[10]：取姬松茸粉末10g，按1: 25加80%乙醇，在60℃提取3次，每次2h，過(guò)濾合并濾液，回收溶劑，真空干燥，備用。姬松茸粗多糖制備[9]：取姬松茸粉末10g，按1:20加蒸餾水，在85℃提取2次，每次2.5h，過(guò)濾合并濾液，濃縮至一半體積，加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為75%，置于4℃靜置過(guò)夜，離心，取沉淀真空干燥，備用。

2.2 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)及接種HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%左右時(shí)，加入0.25%胰酶-EDTA消化液消化傳代，以4×104個(gè)/ mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（OD值），每組取6個(gè)復(fù)孔的平均值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（OD處理組-OD空白組）/（OD正常組-OD空白組）×100%。

2.4 不同劑量UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組和UVB各劑量組，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，空白對(duì)照組和正常對(duì)照組用錫箔紙覆蓋，UVB各劑量組分別用0、10、20、30、40、50、60、70、80mj/cm2的UVB照射，繼續(xù)培養(yǎng)24h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 姬松茸不同提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組和各劑量給藥組，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，各劑量給藥組按提取物浸膏量分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4mg·mL-1的含藥培養(yǎng)液，空白對(duì)照組和正常對(duì)照組加入MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 姬松茸不同提取物對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞存活率的影響將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、模型組和各劑量給藥組，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，各劑量給藥組分別加入相應(yīng)劑量的含藥培養(yǎng)液，其他各組加MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，空白對(duì)照組和正常對(duì)照組用錫箔紙覆蓋，模型組和各劑量給藥組給予20mj/cm2的UVB照射，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間細(xì)胞存活率采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 姬松茸各提取物得率將姬松茸按照2.1項(xiàng)下的方法提取干燥后，得提取物提取得率，見(jiàn)表1。

表1 姬松茸各提取物的得率Tab.1 Extract yield of Agaricus blazei Murrill

3.2 不同劑量UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)一致，排列緊密，邊界清楚，呈典型的鋪路石樣。UVB各劑量組細(xì)胞均表現(xiàn)為不同程度的損傷，細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞變圓，間隙變大，形態(tài)模糊，出現(xiàn)漂浮、碎片（圖1）。不同劑量UVB照射后細(xì)胞存活率明顯下降（P＜ 0.01），且其下降程度與UVB照射劑量呈正相關(guān)（表2）。當(dāng)UVB劑量達(dá)20mj/cm2時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞的抑制率達(dá)46.77%，UVB的半數(shù)抑制劑量為19.40mj/ cm2，95%置信區(qū)間為（16.97，21.69），故選擇20mj/cm2作為造模劑量。

圖1 不同劑量UVB照射后的HaCaT細(xì)胞形態(tài)（×10）Fig.1 Morphology of HaCaT cells irradiated by different dose of UVB（×10）

表2 不同劑量UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Tab.2 The cell viability of HaCaT cells irradiated by different dose of UVB（±s，n=3）

表2 不同劑量UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Tab.2 The cell viability of HaCaT cells irradiated by different dose of UVB（±s，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01。Note:Compared with normal control group,**P＜0.01.

UVB造模劑量（mj/cm2）細(xì)胞存活率（%）0 10 20 30 40 50 60 70 80 100.00±0.00 77.42±3.66**53.23±2.99**25.75±0.88**18.73±3.65**14.46±1.52**10.73±3.67**8.79±3.26**8.32±3.47**

3.3 姬松茸不同提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響由表3可知，與正常對(duì)照組相比，姬松茸水提物在0.2～4mg·mL-1濃度時(shí)HaCaT細(xì)胞存活率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；姬松茸醇提物在0.1～2mg·mL-1濃度時(shí)HaCaT細(xì)胞存活率明顯提高，劑量增大則細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；姬松茸粗多糖在0.2～1mg·mL-1濃度量時(shí)HaCaT細(xì)胞存活率明顯提高，劑量增大則對(duì)細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果顯示水提物在0.1～4mg·mL-1、醇提物在0.1～ 2mg·mL-1、粗多糖在0.1～1mg·mL-1濃度時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，因此各自選擇以上濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的安全給藥濃度。

表3 姬松茸不同提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Tab.3 The cell viability of HaCaT cells treated by different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

表3 姬松茸不同提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Tab.3 The cell viability of HaCaT cells treated by different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with normal control group,*P＜0.05,**P＜0.01.

濃度（mg·mL-1）水提物（%）醇提物（%）粗多糖（%）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 2 3 4 100.00±0.00 103.07±1.25 103.91±1.05*104.66±0.67*105.84±0.92**107.06±1.38**108.26±2.10**109.22±1.72**109.97±1.82**110.84±2.86**111.94±2.26**113.21±3.36**112.74±1.91**109.52±3.72**100.00±0.00 103.65±1.11*105.71±1.45**107.36±1.23**108.64±1.40**109.05±1.36**111.37±1.14**111.92±1.01**112.64±0.59**114.35±0.61**115.79±1.20**119.39±0.90**61.47±3.33**3.35±0.65**100.00±0.00 102.36±0.50 103.66±0.76*105.01±1.91**106.36±1.77**108.42±1.96**109.64±1.84**110.35±1.67**110.84±1.44**111.44±1.64**113.57±2.27**71.30±3.32**9.56±0.99**6.93±2.61**

3.4 姬松茸不同提取物對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞存活率的影響由表4可知，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，各劑量給藥組細(xì)胞存活率均增加。姬松茸水提物隨著給藥劑量的增加，HaCaT細(xì)胞的存活率呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在1～4mg·mL-1濃度時(shí)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；姬松茸醇提物隨著給藥劑量的增加，HaCaT細(xì)胞的存活率呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在1～2mg·mL-1濃度時(shí)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；姬松茸粗多糖隨著給藥劑量的增加，HaCaT細(xì)胞的存活率逐漸增加，且在0.5～1mg·mL-1濃度時(shí)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

4 討論

日光中的紫外線是導(dǎo)致皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的重要因素[12]。紫外線根據(jù)波段可分為長(zhǎng)波紫外線（ultraviolet A，UVA）、UVB和短波紫外線（ultraviolet C，UVC），UVC可以被大氣臭氧層吸收和散射，因此UVC不能到達(dá)地球表面。能照射到地球上的陽(yáng)光紫外線是UVA和UVB，分別占總量的95%和5%[12]。UVB的生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)度是UVA的800～1000倍[2]，可直接作用于DNA或誘發(fā)氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基等機(jī)制作用于機(jī)體細(xì)胞，導(dǎo)致皮膚中自由基濃度增高，是導(dǎo)致皮膚光老化的最主要因素[13]。所以本實(shí)驗(yàn)選擇UVB為造模光源。

UVB主要作用于表皮，角質(zhì)形成細(xì)胞占表皮細(xì)胞的90%以上，角質(zhì)形成細(xì)胞是UVB作用的靶細(xì)胞[14]。HaCaT細(xì)胞是人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性上與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞相似，保持有正常人角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和增殖的特性，無(wú)腫瘤原性[15]，且培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，易于增殖，能大規(guī)模培養(yǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用HaCaT細(xì)胞株作為研究對(duì)象。

表4 姬松茸不同提取物對(duì)UVB造模HaCaT細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Tab.4 The cell viability of HaCaT cells irradiated by UVB after treatment with different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

表4 姬松茸不同提取物對(duì)UVB造模HaCaT細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Tab.4 The cell viability of HaCaT cells irradiated by UVB after treatment with different extraction of Agaricus blazei Murrill（±s，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。Note:Compared with normal control group,**P＜0.01;compared with model group,##P＜0.01.

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由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同劑量UVB照射后細(xì)胞存活率均下降，且呈劑量依賴性，當(dāng)UVB達(dá)20mj/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率為53.23%，較正常對(duì)照組有顯著差異（P＜0.01），接近半數(shù)抑制，且與UVB達(dá)到地球表面的輻射強(qiáng)度相當(dāng)，為18～30mj/cm2[16]，若再增大造模劑量，細(xì)胞損傷過(guò)度，可能出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的凋亡，不利于觀察一些藥物的保護(hù)作用，故選擇20mj/cm2作為造模劑量。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行UVB造模時(shí)，在兩組細(xì)胞之間增加一列PBS，將兩組細(xì)胞隔開(kāi)，避免細(xì)胞在造模時(shí)互相受到影響。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姬松茸水提物、醇提物及粗多糖在適宜濃度時(shí)均可抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞光損傷并提高其細(xì)胞存活率。姬松茸水提物在1～4mg·mL-1、醇提物在1～2mg·mL-1、粗多糖在0.5～1mg·mL-1具有一定的光保護(hù)作用。相比而言，低濃度（≤1mg·mL-1）時(shí)粗多糖的保護(hù)作用較好，較高濃度（＞1mg·mL-1）則水提物的作用較強(qiáng)，且當(dāng)水提物劑量為3mg·mL-1時(shí)，保護(hù)作用最佳。姬松茸提取物能夠保護(hù)HaCaT細(xì)胞而減少UVB引起的損傷，在一定范圍可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與姬松茸提取物抑制UVB輻射引起的細(xì)胞氧化損傷，增強(qiáng)其抗氧化能力有關(guān)。因本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還僅是處于細(xì)胞水平的體外初步研究，因此具體的抗光損傷的分子機(jī)制和體內(nèi)保護(hù)效果還有待進(jìn)一步深入研究。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為姬松茸提取物對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的光損傷的保護(hù)作用提供了一定的理論依據(jù)，為姬松茸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步研究其保護(hù)作用的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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[13]郭院霞．UVB誘導(dǎo)細(xì)胞損傷機(jī)制及紅景天苷保護(hù)作用的初步研究[D]．廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013:1. GUO Yuanxia.The preliminary study on UVB-induced celldamagemechanismsandtheprotectiveettectof Salidroside[D].Guangzhou:Journal of Southern Medical U-niversity,2013:1.

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“浙醫(yī)研究”專欄特別征稿啟事

悠邈浙江，文化繁盛，學(xué)術(shù)華榮。為彰顯傳統(tǒng)學(xué)養(yǎng)地域特征，研索前賢名哲經(jīng)驗(yàn)智慧，挖掘吳越浙江中醫(yī)流派，《浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》特設(shè)“浙醫(yī)研究”專欄。凡系新中國(guó)成立之前浙江中醫(yī)名家名著、醫(yī)方醫(yī)案、傳承發(fā)展之研究論文，均在本刊長(zhǎng)期征稿之列，并將優(yōu)先錄用發(fā)表。誠(chéng)邀廣大作者踴躍賜稿！

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《浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

2017年5月18日

Protective Effect of Different Extraction of Agaricus blazei Murrill on HaCaT Cells Damaged by UVB

ZHU Yan,HUANG Zhen,ZHONG Xiaoming College of Pharmacy Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To investigate the protective effects of different extraction of Agaricus blazei Murrill on HaCaT cells damaged by UVB.[Methods]The cell viability which was detected by MTT method was used to determine the impact of different dose of UVB and different extraction of Agaricus blazei Murrill on normal HaCaT cells and HaCaT cells damaged by UVB.[Results]①The HaCaT cells viability declined after irradiation with UVB,and it was a dose-dependent manner.The cell viability was 53.23%when the dose of UVB was 20mj/cm2.②The water extraction at the concentration of 0.2～4mg·mL-1, aqueous extraction at the concentration of 0.1～2mg·mL-1and crude polysaccharide at the concentration of 0.2～1mg·mL-1could promote the proliferation of HaCaT cells,while aqueous extraction and crude polysaccharide inhibited the proliferation of HaCaT cells at higher concentrations.③The water extraction at the concentration of 1～4mg·mL-1,aqueous extraction at the concentration of 1～2mg·mL-1and crude polysaccharide at the concentration of 0.5～1mg·mL-1could enhance the cells viability which was irradiated by 20mj/cm2UVB（P＜0.01）.[Conclusion]The different extraction of A garicus blazei Murrill all could relieve the photo-damage caused by UVB,and it has the potential of anti-photoaging.

Agaricus blazei Murrill；water extraction；aqueous extraction；crude polysaccharide；HaCaT；UVB；protective effect

R282.71

A

1005-5509（2017）06-0458-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.06.003

2017-01-06）

浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2015R410007）

Fund project:New-shoot Talents Program of Zhejiang Province(2015R410007)

鐘曉明，E-mail：k6_zxm@sina.com