江虹,龐向東,洪歆,何婷婷

(長江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，408100)

多波長褪色光度法測定鮮檸檬中的檸檬酸

江虹*,龐向東,洪歆,何婷婷

(長江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，408100)

建立了測定檸檬酸的多波長分光光度法。在pH 6.15 的Tris-鹽酸緩沖溶液中，燦爛綠與檸檬酸在可見光區(qū)發(fā)生褪色反應(yīng)，生成具有3個明顯負(fù)吸收峰的綠色離子締合物，并出現(xiàn)褪色現(xiàn)象。最大、次大和最小的負(fù)吸收波長分別位于652、582和426 nm處。檸檬酸在0.02～3.84 mg/L(652 nm 和582 nm)和0.48～3.84 mg/L(426 nm)內(nèi)遵從比爾定律，表觀摩爾吸光系數(shù)(κ)分別為 3.33×104、2.84×104和1.44×104L/(mol·cm)，定量限為 0.019 g/100 g(652 nm 和582 nm)和 0.45 g/100 g(426 nm)。采用雙波長或三波長疊加法測定，它們的靈敏度分別可達(dá)6.16×104L/(mol·cm)和7.61×104L/(mol·cm)，定量限均為0.019 g/100 g。還探討了適宜的反應(yīng)條件、主要分析化學(xué)性質(zhì)及絡(luò)合比。方法用于新鮮檸檬中檸檬酸含量的測定，回收率為98.85%～101.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為2.2%～2.5%。

檸檬；檸檬酸；燦爛綠；單波長；雙波長；三波長；褪色反應(yīng)；分光光度法

檸檬酸為食用酸類，具有增強人體內(nèi)正常代謝，促進(jìn)脂肪分解，快速減肥，降血壓、排出血液中毒素、美白、祛斑、防蟲、清潔污漬等作用。檸檬酸對人體雖無直接危害，但它在人體內(nèi)會促進(jìn)鈣的排泄和沉積，若長期食用含檸檬酸的食品，可能導(dǎo)致低鈣血癥，增加患十二指腸癌的幾率[1]。為了有效控制檸檬酸的用量，保障人們的身體健康，對檸檬中檸檬酸的分析具有一定意義。

目前，測定檸檬酸的方法主要有：高效液相色譜法[2-9]，氣相色譜法[10-11], 離子色譜法[12-14]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]，電化學(xué)法[16-17]和分光光度法[18-19]等。高效液相色譜法儀器較貴，不易普及，且樣品的前處理麻煩。氣相色譜法快速，但樣品的前處理較復(fù)雜。離子色譜法能很好地測定有機酸含量，但因淋洗液和柱子填料的特殊性，對樣品中的含量有嚴(yán)格限定，不易普及。電化學(xué)法中有的分離度較高，但靈敏度低，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差，有的線性范圍窄，選擇性較差。分光光度法所用儀器價廉，操作簡便，易于普及，長期以來受到人們的青睞。目前，用可見分光光度法測定檸檬酸的報道較少，且存在方法靈敏度差，線性范圍窄[3-4]問題。因此，進(jìn)一步研究靈敏度高、選擇性好，線性范圍寬的測定檸檬酸的分光光度法有一定意義。實驗發(fā)現(xiàn)，以燦爛綠為探針，在可見光區(qū)，單波長法、雙波長法及三波長法均可用于檸檬酸的測定，且方法有較高的靈敏度和選擇性。方法用于新鮮檸檬中檸檬酸的測定，結(jié)果滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗試劑：檸檬酸(citric acid，CTA)標(biāo)準(zhǔn)溶液：192.1 mg/L 貯備液，用時稀釋10倍。燦爛綠(brilliant green， BRG)溶液：1.0×10-3mol/L。Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖溶液：0.20 mol/L Tris溶液與0.10 mol/L HCl混合，用酸度計測定，配成pH 3.0～9.5的系列溶液。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

樣品：重慶地區(qū)3種新鮮檸檬(1#～3#)，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010型紫外-可見分光光度計，日本日立公司；pHS-3C 精密酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 樣品處理

分別取1#～3# 新鮮檸檬多個，去皮，去核，將果肉榨汁后攪勻。準(zhǔn)確稱取1# 檸檬汁 10.567 2 g，2# 檸檬汁10.312 9 g，3# 檸檬汁 10.663 4 g，過濾后，將濾液分別置于1 000 mL容量瓶中，用水定容。取上述各溶液10 mL 分別置于100 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻，即為各待測液。

1.4 實驗方法

于10 mL 具塞比色管中，準(zhǔn)確加入3.0 mL 1.0×10-3mol/L燦爛綠溶液，0.5 mL pH 6.15 Tris-HCl緩沖溶液，搖勻，再加適量的19.21 mg/L 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣液，用水定容，搖勻，15 min 后，在紫外-可見分光光度計上，用1.0 cm 比色皿，以試劑空白作參比，掃描吸收光譜，記錄可見光區(qū)652、582和426 nm處體系的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜特征

從圖1可知，在可見光區(qū)，檸檬酸幾乎無吸收(曲線1)，燦爛綠有較強吸收，最大吸收波長為620 nm(曲線2)。當(dāng)在燦爛綠的酸性溶液中(綠色)加入適量檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后，產(chǎn)生明顯的褪色現(xiàn)象，可見光區(qū)，光譜曲線上出現(xiàn)3個較強的褪色峰(曲線3～8)。最大褪色峰位于652 nm，紅移32 nm；次大褪色峰位于582 nm，藍(lán)移38 nm；最小褪色峰位于426 nm，紫移194 nm。波移說明檸檬酸和燦爛綠在弱酸性的Tris-HCl緩沖溶液中反應(yīng)確實生成了新物質(zhì)。新物質(zhì)的吸光度絕對值與一定濃度范圍的檸檬酸的質(zhì)量濃度在652、582和426 nm 處均有線性關(guān)系(曲線3～8)，且服從朗伯-比爾定律。故此3個波長處，均可用單波長法測定檸檬酸的含量。再根據(jù)吸光度的加和性，雙波長疊加(652 nm+582 nm)法或三波長疊加(652 nm+582 nm+426 nm)法均可用于檸檬酸的定量分析，且靈敏度比單波長法約高2～5倍。

圖1 吸收光譜Fig.1 The absorption spectra注：1-1.92 mg/L檸檬酸(水作參比)；2-3.0×10-5 mol/L燦爛綠(水作參比); 3～8，分別為0.384、0.768、1.54、2.31、3.07、3.84 mg/L檸檬酸與3.0×10-4 mol/L燦爛綠的混合液(試劑空白作參比); 溶液pH均為6.15

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 pH 值

考察了不同pH 值的Tris-HCl緩沖溶液對體系在可見光區(qū)3個負(fù)吸收波長處的吸光度絕對值(│A│)的影響，結(jié)果見圖2。可見，pH值在 5.6～6.8內(nèi)，體系在各負(fù)吸收波長處的│A│較大，其靈敏度較高。實驗用pH 6.15 的Tris-HCl緩沖溶液，適宜用量0.5 mL。

圖2 pH值對│A│的影響Fig.2 Effect of buffer pH on │A│

2.2.2 燦爛綠溶液的濃度

考察了不同濃度的燦爛綠溶液對體系在可見光區(qū)3個負(fù)吸收波長處│A│的影響，結(jié)果見圖3。可見，燦爛綠溶液在2.5～3.5 mol/L內(nèi)，│A│較大，靈敏度較高。當(dāng)燦爛綠溶液的濃度<2.5 mol/L 時，由于反應(yīng)不完全，其│A│較??；當(dāng)燦爛綠溶液的濃度>3.5 mol/L 時，因燦爛綠過量太多，其自身的光吸收使體系的│A│變小。實驗用1.0×10-3mol/L 燦爛綠溶液3.0 mL。

圖3 燦爛綠溶液濃度對│A│的影響Fig.3 Effect of brilliant green concentration on │A│

2.2.3 試劑加入順序

考察了各試劑在不同加入順序時對體系在可見光區(qū)3個負(fù)吸收波長處的│A│的影響。結(jié)果表明按任一順序加入各試劑，其│A│值基本不變。故實驗可按任意順序加入試劑。

2.2.4 反應(yīng)時間及穩(wěn)定性

考察了不同放置時間對體系在可見光區(qū)3個負(fù)吸收波長處的│A│的影響，結(jié)果見圖4。可見，開始時，隨著體系溶液放置時間的增加，3個負(fù)吸收波長處的│A│均在逐漸增大，表明此時的反應(yīng)并未完全，當(dāng)時間增至10 min 后，各波長處體系的│A│均趨于平穩(wěn)，表明反應(yīng)在10 min內(nèi)即可反應(yīng)完全，其穩(wěn)定時間至少1.5 h。實驗選在10 min 后測定。

圖4 時間對│A│的影響Fig.4 Effect of time on │A│

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按實驗方法配制檸檬酸的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液， 并掃

描吸收光譜，作A-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。該方法的一元線性回歸方程、回歸系數(shù)、線性范圍、表觀摩爾吸光系數(shù)及定量限等見表1。

2.4 絡(luò)合比

用摩爾比法和連續(xù)變化法測得體系絡(luò)合比為檸檬酸∶燦爛綠=2∶3,即 CTA2BRG3。

反應(yīng)機理：燦爛綠是一種三苯甲烷類的堿性染料，其分子結(jié)構(gòu)中2個乙氨基上的氮原子接受質(zhì)子形成大陽離子，而檸檬酸的分子結(jié)構(gòu)上有3個羧酸根離子，3 mol燦爛綠大陽離子與2 mol檸檬酸陰離子以靜電引力結(jié)合生成離子締合物CTA2BRG3。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)

2.5 共存物質(zhì)的影響

在652 nm 處，考察了一些常見物質(zhì)對測定1.92 mg/L檸檬酸的影響。結(jié)果表明，當(dāng)相對誤差不大于 ±5% 時，以下物質(zhì)不干擾測定：100倍的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-果糖、L-色氨酸、L-白氨酸、L-賴氨酸、K+、Na+、NH4+、NO3-、Cl-、PO43-、SO42-；50倍的Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、S2O32-、SO32-；30倍的蘋果酸、酒石酸、山梨酸、苯甲酸、抗壞血酸、Mn2+、Pb2+、Fe2+、C2O42-、CO32-；5倍的Cu2+、Al3+、Fe3+?？梢?，食品中常見的有機酸、糖類及大多數(shù)常見陰、陽離子不干擾測定。雖然Cu2+、Al3+、Fe3+的允許量較小，但它們在檸檬中的共存量一般很小。故方法有較好的選擇性。

2.6 樣品分析

取1.3中各待測樣液1.0 mL，按1.4的實驗方法，采用靈敏度相對最高的三波長法進(jìn)行分析，各平行測定6份，同時做加標(biāo)回收試驗(n=6)，判斷方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

以燦爛綠為探針測定檸檬酸的多波長褪色光度法，操作簡便，試劑價廉易得，樣品處理簡單、安全，線性范圍較寬，準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均較高，完全能滿足定量分析要求，方法適于批量新鮮檸檬中檸檬酸的快速分析。

表2 樣品分析結(jié)果及回收試驗(n=6)

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Determination of citric acid in the fresh lemon by multi-wavelength color fading spectrophotometry

JIANG Hong*, PANG Xiang-dong, HONG Xin, HE Ting-ting

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Yangtze Normal University, Chongqing Key Collaborative Innovation Center for Green Development in Wuling Mountain Areas, Yangtz Normal University, Chongqing 408100,China)

A fast multi-wavelength color fading spectrophotometry for quantifying citric acid in fresh lemon was developed. In Tris-hydrochloric acid buffer pH 6.15 solution , brilliant green reacted with citric acid to form a green ion association complex with obvious three negative absorption peak and bleaching effect in visible area. The maximum and the second largest and the smallest negative absorption wavelength was located at 652 nm and 582 nm and 426 nm respectively. Beer’s law was obeyed in definite mass concentration range within 0.02-3.84 mg/L(652 nm and 582 nm) or 0.48-3.84 mg/L(426 nm) of citric acid. Their apparent molar absorptivity (κ) were 3.33×104and 2.84×104and 1.44×104L/(mol·cm) respectively with the limitation of quantitation of 0.019 g/100 g(652 nm 和582 nm) and 0.45 g/100 g(426 nm). The sensitivity of double wavelengths or three-wavelength superposition were 6.16×104L/(mol·cm) and 7.61×104L/(mol·cm) respectively with the quantitative limits were 0.019 g/100 g. The optimum reaction conditions, the main properties of analytical chemistry and the compound ratio were studied. The method were applied to determine the content of citric acid in fresh lemon with spiked recoveries and RSD% (n=6) in the ranges of 98.85%-101.1% and 2.2%-2.5% respectively.

lemon; citric acid; brilliant green; single wavelength; double wavelength; three-wavelength; color-fading reaction; spectrophotometry

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704036

學(xué)士，教授(本文通訊作者,E-mail: jianghongch @163.com)。

重慶市教委科技基金資助項目(KJ1401226);長江師范學(xué)院科技基金資助項目(2015CXX080)

2016-07-01，改回日期：2016-11-12