饒紅，韓玥，郭錚蕾，徐姍，李偉，谷強(qiáng)，林遠(yuǎn)輝

(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京，100026)

轉(zhuǎn)基因食品定量檢測方法的驗(yàn)證

饒紅，韓玥*，郭錚蕾，徐姍，李偉，谷強(qiáng)，林遠(yuǎn)輝

(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京，100026)

按歐盟聯(lián)合研究中心(Joint Reaserch Center，JRC)的歐盟網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室(European Network of GMO laboratories，ENGL)方法驗(yàn)證工作組編制的指南文件的要求，對《GB/T 19495.5—2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》進(jìn)行方法驗(yàn)證。分別驗(yàn)證了脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取質(zhì)量，方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和相對定量限4個(gè)指標(biāo)。經(jīng)過驗(yàn)證，選用的DNA提取試劑盒提取質(zhì)量合格；檢測值在可接受參考值的±25%內(nèi)，準(zhǔn)確度良好；相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于25%，重復(fù)性良好；相對定量限為0.1%轉(zhuǎn)基因含量。依照指南對國標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果證明該指南在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證中具有指導(dǎo)性作用。

轉(zhuǎn)基因食品檢測；定量檢測；方法驗(yàn)證

在開始檢測之前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能夠正確地應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，如果標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)生了變化，應(yīng)重新進(jìn)行驗(yàn)證[1]。目前，國際上通用的檢測實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是《ISO/IEC 17025:2005 檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》，在國內(nèi)被轉(zhuǎn)化為《CNAS-CL01:2006 檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》，作為檢測實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和管理所依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)際工作中，一個(gè)檢測實(shí)驗(yàn)室開展檢測前最關(guān)鍵的是能夠證明具備正確進(jìn)行檢測的能力，如果是依照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測，那么實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能夠準(zhǔn)確理解標(biāo)準(zhǔn)并正確使用。17025和CL01只給出了方法驗(yàn)證的定義。但是對于具體如何進(jìn)行方法驗(yàn)證沒有給出具體指南。在國際和國內(nèi)，各領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室都在開展本領(lǐng)域內(nèi)檢測方法驗(yàn)證的相關(guān)研究，但是關(guān)于轉(zhuǎn)基因檢測方法的驗(yàn)證，一直以來少有科學(xué)性、有效性的依據(jù)。本文修改采用了歐盟聯(lián)合研究中心(Joint Reaserch Center，JRC)的權(quán)威指南文件：《Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods》(EUR 24790 EN，JRC)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測方法驗(yàn)證的研究。歐盟聯(lián)合研究中心是歐盟委員會的內(nèi)部科研機(jī)構(gòu)，其發(fā)布的文件在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域公認(rèn)為權(quán)威的指導(dǎo)性文件。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)需要識別相應(yīng)的人員能力、設(shè)施和環(huán)境、設(shè)備、檢測所需試劑耗材和標(biāo)物是否滿足檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的要求等[2-4]。如果標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)生了變化，應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證應(yīng)有記錄?？傊?，實(shí)驗(yàn)室在將方法引入檢測之前，應(yīng)從“人”、“機(jī)”、“料”、“法”、“環(huán)”等方面驗(yàn)證其有能力按照標(biāo)準(zhǔn)方法開展檢測活動。

在滿足了“人”、“機(jī)”、“料”、“環(huán)”的硬件要求后，還應(yīng)通過試驗(yàn)證明結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，如標(biāo)準(zhǔn)給出的精密度、線性范圍、定性檢測限和定量檢測限等方法特性指標(biāo)[5]，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對或參加能力驗(yàn)證。“法”，即標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的各項(xiàng)特性指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)室能否實(shí)現(xiàn)，就成為了方法驗(yàn)證中最重要的技術(shù)內(nèi)容，也是實(shí)驗(yàn)室最應(yīng)著力驗(yàn)證的目標(biāo)。

由歐盟聯(lián)合研究中心(JRC)的歐盟網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室(European Network of GMO laboratories，ENGL)方法驗(yàn)證工作組編制的《JRC科學(xué)技術(shù)報(bào)告-經(jīng)確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因檢測分析方法的驗(yàn)證》(Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods)[6]，由JRC作為指南性文件發(fā)布。本文按照該指南要求，以《GB/T 19495.5—2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》[7]為實(shí)例，對該標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法進(jìn)行了方法驗(yàn)證。經(jīng)試驗(yàn)研究，驗(yàn)證了該方法的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取效率、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、相對定量限4個(gè)特性指標(biāo)[8]，這些指標(biāo)均達(dá)到了該指南文件的技術(shù)要求，說明今后檢測實(shí)驗(yàn)室可以此指南文件為依據(jù)開展相關(guān)領(lǐng)域的方法驗(yàn)證活動。

1 材料與設(shè)備

1.1 主要材料

DNA提取試劑盒(QIAGENDNeasy? Plant Mini Kit)，DEPC水(生工Sangon Biotech)，PCR反應(yīng)預(yù)混液(AB TaqMan? Gene Expression Master Mix)，引物，探針，濃度分別為5、1、0.5、0.1%的GA21品系陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(AOCS0407-B)，玉米渣(超市購買)。

1.2 主要儀器

紫外分光光度儀(BECKMAN COULTER DU 800)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7900)，高速冷凍離心機(jī)(eppendorf Centrifuge 5810R)，臺式小型離心機(jī)(eppendorf Centrifuge 5424)，漩渦振蕩器(IKA MS2)，PCR反應(yīng)管(Axygen)，10、20、100、200、1000 uL微量進(jìn)樣器(eppendorf)。

1.3 引物和探針

引物探針序列按照《GB/T 19495.5—2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》附錄E中轉(zhuǎn)基因玉米GA21的zSSIIb基因(玉米內(nèi)源基因)和結(jié)構(gòu)特異基因(GA21品系結(jié)構(gòu)特異性基因)的序列合成，見表1。

表1 引物和探針序列

2 方法與結(jié)果

2.1 提取DNA

使用QIAGENDNeasy? Plant Mini Kit，分別對濃度5%、1%、0.5%、0.1%的GA21品系陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和超市購買的純玉米渣進(jìn)行DNA提取。

2.2 DNA 提取質(zhì)量驗(yàn)收

對純玉米渣每次同時(shí)進(jìn)行2份平行提取，連續(xù)3次[9]。2個(gè)平行提取的DNA連續(xù)4倍稀釋(1∶1，1∶4,1∶16,1∶64和1∶256)的5個(gè)點(diǎn)的ZEIN基因(玉米內(nèi)源基因)進(jìn)行檢測[10]，3次檢測結(jié)果見表2～表4、圖1～圖3。為了評估抑制劑的存在，4個(gè)稀釋度的樣品的Ct值用線性回歸計(jì)算得到一個(gè)等式。從線性回歸推算出的“未稀釋”樣品的Ct值與同一個(gè)樣品的測量Ct值進(jìn)行對比。JRC指南中規(guī)定，當(dāng)同時(shí)滿足回歸線的斜率在-3.6～-3.1；判定系數(shù)(R2)≥0.98；測量Ct和推算Ct的差(ΔCt)低于0.5這3個(gè)條件時(shí)，則證明該提取方法是適宜的，提取產(chǎn)物中不含抑制劑。其中，未稀釋濃度的推導(dǎo)Ct值用excel中函數(shù)中INTERCEPT求得。

表2 第1次試驗(yàn)ΔCt

表3 第2次試驗(yàn)ΔCt

續(xù)表3

稀釋因子實(shí)際測量CtCt平均值ΔCt期望ΔCt稀釋因子的對數(shù)1∶163152034431593453155691996782-120411∶6433557655336374833597572040672-180621∶256360848835903545實(shí)際測量Ct35994212396642-24082Ct平均值Excel推導(dǎo)Ct推導(dǎo)Ct?Ct平均值結(jié)果工作液27538067274242627481162734129-013987OK

表4 第3次試驗(yàn)ΔCt

圖1 第1次試驗(yàn)斜率R2Fig.1 The slope R2 of the first test

圖2 第2次試驗(yàn)斜率R2Fig.2 The slope R2 of the second test

圖3 第3次試驗(yàn)斜率R2Fig.3 The slope R2 of the third test

從圖表的結(jié)果可見，3次試驗(yàn)的ΔCt分別為-0.121 31、-0.139 87、0.071 57；線性回歸方程的斜率分別為-3.54 4、-3.545、-3.540；R2系數(shù)分別為0.996、0.997、0.999。3次試驗(yàn)均滿足JRC指南中規(guī)定的3項(xiàng)要求[11]，可見使用QIAGEN DNeasy?Plant Mini Kit試劑盒提取的產(chǎn)物中不含抑制劑，提取質(zhì)量合格，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 提取物濃度的測定

用BECKMAN COULTER DU 800紫外分光光度計(jì)分別GA21品系陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(+)和超市購買的純玉米渣(-)的提取產(chǎn)物進(jìn)行檢測，得到如下結(jié)果(見表5)。

表5 提取物DNA相對濃度

利用公式(1)計(jì)算提取物的絕對濃度(copies/μL)，結(jié)果見表6。

提取物絕對濃度/(copies·μL-1)=(6.02×1023)×(DNA濃度ng/μL×10-9)/(玉米基因組堿基數(shù)2.4×109×345)

(1)

表6 提取物DNA絕對濃度

2.4 準(zhǔn)確度、重復(fù)性、定量限試驗(yàn)設(shè)計(jì)

JRC指南中規(guī)定，需要16個(gè)PCR平行結(jié)果，才可以比較準(zhǔn)確地計(jì)算出所驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、定量限，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)例見圖4。

圖4 準(zhǔn)確度、重復(fù)性、定量限試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)例Fig.4 Example of accuracy, repetitive and LOQ experiment design

按照圖4的設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)結(jié)果見表7和表8。

2.5 準(zhǔn)確度驗(yàn)證

JRC指南中規(guī)定，準(zhǔn)確度應(yīng)在可接受參考值的±25%內(nèi)。對方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，檢測條件(反應(yīng)量、 PCR儀等)應(yīng)該和日常檢測一致。至少選擇包括接近定量限在內(nèi)的3個(gè)不同濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證[12-13]。每個(gè)濃度水平要得到16個(gè)PCR平行的結(jié)果(見2.4)。平均值的計(jì)算使用公式(2)。

表7 PCR Plate 1 不同轉(zhuǎn)基因水平提取物檢測Ct值

表8 PCR Plate 2 不同轉(zhuǎn)基因水平提取物檢測Ct值

(2)

根據(jù)表7、表8的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算得到以下結(jié)果。

2.5.1 5%轉(zhuǎn)基因水平

2.5.2 1%轉(zhuǎn)基因水平

2.5.3 0.5%轉(zhuǎn)基因水平

2.5.4 0.1%轉(zhuǎn)基因水平

2.6 重復(fù)性驗(yàn)證

按照J(rèn)RC指南要求，接著應(yīng)對重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。重復(fù)性(Repeatability)是在使用相同方法和正確操作情況下，由同一操作人員，在同一實(shí)驗(yàn)室，使用同一儀器，并在短期內(nèi)，作多個(gè)單次測試結(jié)果，在一定概率水平(一般指95%)兩個(gè)獨(dú)立測試結(jié)果的最大差值。使用可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(Repeatability standard deviation，RSDr)來衡量重復(fù)性的優(yōu)劣。JRC指南規(guī)定RSDr應(yīng)≤25%。

對方法重復(fù)性的驗(yàn)證需要在重復(fù)條件下通過PCR平行試驗(yàn)進(jìn)行評估[14]。重復(fù)性應(yīng)適用于所有轉(zhuǎn)基因水平的測試。檢測條件(反應(yīng)量、 PCR儀等)應(yīng)該和日常檢測一致。至少要得到16個(gè)獨(dú)立測量結(jié)果(見2.4)。選取5%、1%、0.5%、0.1%這4個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量的樣品進(jìn)行檢測。方差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、總體的標(biāo)準(zhǔn)差平均數(shù)、相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差分別通過公式(3、4、5、6)計(jì)算得到。

(3)

(4)

(5)

式中：n表示每個(gè)提取的復(fù)制數(shù)，n=4；k表示每個(gè)反應(yīng)管分別的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)量，k=4；分母的區(qū)間是16-8=8。

(6)

根據(jù)表7、8的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算得到以下結(jié)果。

2.6.1 5%轉(zhuǎn)基因水平

使用公式(3)得出4個(gè)方差Var15= 1.997 92×10-6、Var25= 3.912 42×10-6、Var35=1.268 47×10-6、Var45= 3.909 1×10-6。使用公式(4)得出4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差sd15= 0.001 413 5、sd25= 0.001 978、sd35= 0.001 126 3、sd45= 0.001 977 1。使用公式(5)和之前計(jì)算的結(jié)果得到sdGM5= 0.002 039。使用公式(6)計(jì)算出5%轉(zhuǎn)基因水品的相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr=3.76<25，可見在5%轉(zhuǎn)基因水平下，依據(jù)JRC指南的規(guī)定所驗(yàn)證方法的重復(fù)性滿足指南要求。

2.6.2 1%轉(zhuǎn)基因水平

使用公式(3)得出4個(gè)方差Var11=9.382 69×10-9、Var21=8.315 36×10-9、Var31= 1.274 07×10-8、Var41=1.644 86×10-8。使用公式(4)得出4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差sd11=9.686×10-5、sd21=9.119×10-5、sd31=0.000 112 9、sd41=0.000 1283。使用公式(5)和之前計(jì)算的結(jié)果得到sdGM1=0.000 132 6。使用公式(6)計(jì)算出1%轉(zhuǎn)基因水品的相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr=1.12<25，可見在1%轉(zhuǎn)基因水平下，依據(jù)JRC指南的規(guī)定所驗(yàn)證方法的重復(fù)性滿足指南要求。

2.6.3 0.5%轉(zhuǎn)基因水平

使用公式(3)得出4個(gè)方差Var10.5=2.780 19×10-9、Var20.5= 2.248 61×10-9、Var30.5=1.936 46×10-9、Var40.5=1.760 45×10-9。使用公式(4)得出4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差sd10.5=5.273×10-5、sd20.5=4.742×10-5、sd30.5=4.401×10-5、sd40.5=4.196×10-5。使用公式(5)和之前計(jì)算的結(jié)果得到sdGM0.5=5.720 26×10-5。使用公式(6)計(jì)算出0.5%轉(zhuǎn)基因水平的相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr=1.31<25，可見在0.5%轉(zhuǎn)基因水平下，依據(jù)JRC指南的規(guī)定所驗(yàn)證方法的重復(fù)性滿足指南要求。

2.6.4 0.1%轉(zhuǎn)基因水平

使用公式(3)得出4個(gè)方差Var10.1=8.128 1×10-11、Var20.1=9.508 5×10-11、Var30.1=6.876 41×10-11、Var40.1=4.712 58×10-11。使用公式(4)得出4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差sd10.1=9.016×10-6、sd20.1=9.751×10-6、sd30.1=8.292×10-6、sd40.1=6.865×10-6。使用公式(5)和之前計(jì)算的結(jié)果得到sdGM0.1=1.046 88×10-5使用公式(6)計(jì)算出0.1%轉(zhuǎn)基因水平的相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr=0.85<25，可見在0.1%轉(zhuǎn)基因水平下，依據(jù)JRC指南的規(guī)定所驗(yàn)證方法的重復(fù)性滿足指南要求。

四個(gè)轉(zhuǎn)基因含量水平樣品的相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.76、1.12、1.31、0.85%，均小于25%，證明本方法的重復(fù)性滿足指南要求。

2.7 相對定量限(LOQrel)

JRC指南規(guī)定驗(yàn)證一個(gè)方法的相對定量限(LOQrel)可用一個(gè)低轉(zhuǎn)基因濃度的陽性對照樣品的至少10次PCR平行來測量，如果所有平行的結(jié)果都是陽性，這表示LOQrel低于或等于該陽性對照水平。在做重復(fù)性驗(yàn)證的同時(shí)，我們得到了4個(gè)不同轉(zhuǎn)基因含量水平的分別16個(gè)檢測結(jié)果，見表9。

表9 相對定量限(LOQrel)結(jié)果

從表9可見， 0.1%這一轉(zhuǎn)基因水平全部檢出。所以該標(biāo)準(zhǔn)方法的相對定量限(LOQrel)為0.1%。

3 討論

本文依據(jù)JRC指南性文件對《GB/T19495.5—2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》進(jìn)行了方法驗(yàn)證。驗(yàn)證了使用DNA提取試劑盒提取產(chǎn)物不含抑制劑，該方法重復(fù)性良好，且該方法的相對定量限為0.1%轉(zhuǎn)基因濃度水平。證明我實(shí)驗(yàn)室的檢測過程和結(jié)果能夠滿足GB/T19495.5-2004國標(biāo)的檢測需求，本文可作為實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證的實(shí)例參考使用，具有良好的可行性和適用性。

該JRC指南性文件適用于包括食品轉(zhuǎn)基因檢測在內(nèi)的所有分子生物學(xué)檢測，充分考慮到了分子生物學(xué)檢測中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，并科學(xué)細(xì)化了驗(yàn)證步驟。盡管關(guān)注的是PCR方法的驗(yàn)證，但是DNA提取方法的評估是轉(zhuǎn)基因檢測和分子生物學(xué)檢測的關(guān)鍵步驟，因?yàn)樵谑称忿D(zhuǎn)基因檢測中DNA提取的質(zhì)量對最終結(jié)果有重要影響，該指南性文件在此指標(biāo)上給出了詳細(xì)規(guī)定，通過我們的試驗(yàn)研究，證明具有良好的可操作性，便于實(shí)驗(yàn)室在日常引入新方法及方法發(fā)生變更時(shí)進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)參考使用。

通過本文的試驗(yàn)研究，可以看出，《JRC科學(xué)技術(shù)報(bào)告-經(jīng)確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因檢測分析方法的驗(yàn)證》這一指南性文件，可用于指導(dǎo)檢測實(shí)驗(yàn)室開展轉(zhuǎn)基因檢測方法驗(yàn)證工作，特別對分子生物學(xué)定量檢測的方法驗(yàn)證具有指導(dǎo)意義。

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Verification of the quantitative method for GMO foods

RAO Hong， HAN Yue*， GUO Zheng-lei， XU Shan， LI Wei， GU Qiang， LIN Yuan-hui

(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China)

According to the requirements of Guidance document from the European Network of GMO laboratories(ENGL) of JRC, “GB/T 19495.5—2004 Detection of genetically modified organisms and derived products—Quantitative PCR methods based on nucleic acid” including four typical indexes, DNA extraction, accuracy, repeatability and LOQrel, was verified. After verification, DNA extraction kit was qualified. The trueness was within ± 25% of the accepted reference value. RSDr<25.LOQrel was 0.1% GMO content. The verification on the national standard confirms that the guidance is applicable for method verification in laboratory.

GMO testing in foods; quantitative testing; method verification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704033

碩士，主任技師(韓玥為通訊作者，E-mail：hanyuedella2@163.com)。

2016-11-18，改回日期：2017-01-04