李晨陽，趙靖，沈艷華，趙樹欣

(天津科技大學，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

糖酵解抑制劑對紅曲霉乙醇發(fā)酵的影響

李晨陽，趙靖，沈艷華，趙樹欣

(天津科技大學，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

經研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉能以葡萄糖為底物合成乙醇。糖酵解抑制劑氟化鈉在一定程度上抑制菌體生長及乙醇、高級醇的合成?？梢酝茰y出紅曲霉的生長代謝及乙醇合成與糖酵解(EMP)途徑有關。當EMP途徑嚴重受阻時紅曲霉將無法進行丙酮酸和乙醇的合成。

紅曲霉；乙醇；高級醇；糖酵解抑制劑；丙酮酸

紅曲是中國傳統(tǒng)發(fā)酵制品，在我國多地都有生產。紅曲有多種用途，如釀酒、食品著色、釀制腐乳等等。其中采用紅曲釀酒歷史悠久，如浙江金華壽生酒、福建紅曲酒等都是國家非物質文化遺產。釀酒紅曲是將紅曲種曲接種到秈稻上，經制曲培養(yǎng)形成的具有糖化力和發(fā)酵力的一種酒曲，其中包含有紅曲霉、釀酒酵母和細菌等微生物[1]。一般認為在釀酒紅曲中，紅曲霉主要起糖化作用，釀酒酵母主要起發(fā)酵產酒的作用。酒精發(fā)酵是指酵母菌在厭氧條件下通過糖酵解途徑，將葡萄糖降解為丙酮酸，然后在丙酮酸脫羧酶的作用下，將丙酮酸脫羧形成乙醛，乙醛再在乙醇脫氫酶的作用下生成乙醇的過程[2]。本課題組之前的研究中，發(fā)現(xiàn)紅曲霉中的某些種(如安卡紅曲霉、紅色紅曲霉、紫色紅曲霉)具有較高的乙醇生產能力，某些條件下可以達到與釀酒酵母相同的發(fā)酵水平[3]。但是培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式的不同對其發(fā)酵結果有著顯著影響。與釀酒酵母相比，紅曲霉能產生糖化酶，具有同時糖化、發(fā)酵產酒的潛力[4]，且在發(fā)酵過程中可以產生一些有功能的次級代謝產物。如Monacolin k[5]，麥角固醇[6]，色素[7]，γ-氨基丁酸[8]等等，具有很好的開發(fā)前景。

為了了解紅曲霉的乙醇代謝途徑，本研究以從金華紅曲米中分離得到的紅曲霉為發(fā)酵菌株，研究其以葡萄糖為碳源進行乙醇發(fā)酵的特性及代謝途徑，并分析糖酵解抑制劑對紅曲霉乙醇發(fā)酵的影響，以期推測出紅曲霉乙醇發(fā)酵的代謝途徑，為更好地開發(fā)紅曲霉的工業(yè)應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

高溫α-淀粉酶：諾維信公司，活力為20 000 U/g(最佳液化條件為溫度90 ℃，α-淀粉酶添加量為12 U/g，液化時間為1 h)；糖化酶：河北勝利酶制劑有限公司，活力為80 000 U/g(最佳糖化條件為溫度55 ℃，糖化時間1 h)。

1.2 菌株

從金華紅曲米中分離得到的紅曲霉，經鑒定為紅色紅曲霉(Monascusruber)。

1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁斜面培養(yǎng)基[13]。

種子培養(yǎng)基：5%大米粉，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖150 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.03 g/L，115 ℃滅菌30 min。

大米糖化液：大米粉與水1∶3混合，攪拌均勻，加熱進行淀粉糊化、液化。液化條件為α-淀粉酶添加量為12 U/g(大米)，液化溫度為90 ℃，之后在55 ℃下糖化1 h，過濾取清液，加熱滅酶，裝瓶115 ℃滅菌30 min，得到糖度為13 °Brix的培養(yǎng)基。

1.4 菌種分離及鑒定方法

菌種分離方法：稀釋涂布法。

菌種鑒定方法：分子生物學鑒定。

1.5 培養(yǎng)方法

1.5.1 斜面菌種培養(yǎng)

在35 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)7 d，作為實驗用種子。

1.5.2 搖瓶種子培養(yǎng)

接種孢子懸液，30 ℃，150 r/min的旋轉式搖床中培養(yǎng)48 h。

1.5.3 紅曲霉培養(yǎng)方法

種子液10%(v/v)的接種量，30 ℃，150 r/min的旋轉式搖床中培養(yǎng)24 h。之后30 ℃下靜止發(fā)酵5 d。

1.6 分析檢測方法

乙醇和高級醇檢測方法：氣相色譜法[9-10]。

還原糖測定方法：斐林試劑法。

菌體量的測定：干重法。

發(fā)酵失重的測定：每隔12 h測定1次發(fā)酵失重，記錄結果。

丙酮酸的檢測[11]：高效液相色譜法。

糖利用率計算：

酒精發(fā)酵效率計算:

2 結果與分析

2.1 紅曲霉的鑒定

從金華紅曲中分離得到1株紅曲霉，將其命名為MonascusruberMR9，采用分子生物學鑒定方法對其進行鑒定。圖1為紅曲霉MR9的PCR產物電泳圖。

對PCR產物進行測序，并將測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，繪制紅曲霉MR9的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。

圖1 紅曲霉的PCR產物Fig.1 PCR products ofMonascus ruber MR9

圖2 紅曲霉的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Monascus ruber MR9

經鑒定，從金華紅曲中分離得到的紅曲霉MR9為紅色紅曲霉(Monascusruber)。

2.2 紅曲霉的乙醇發(fā)酵

按照1.5.3的方法進行發(fā)酵，得到以下結果。從表1可以看出紅曲霉具有乙醇生成能力。

表1 紅曲霉在兩種培養(yǎng)基中產乙醇的比較

從圖3的發(fā)酵曲線可以確定，發(fā)酵過程中伴隨有氣體生成。

圖3 紅曲霉在兩種培養(yǎng)基中發(fā)酵失重的變化Fig.3 Weigh loss during ethanol fermentation by Monascus ruber MR9 from two kinds of medium

從表2可知，紅曲霉的乙醇發(fā)酵與釀酒酵母相似。在糖酵解過程中生成丙酮酸，進而合成氨基酸。通過氨基酸的分解代謝途徑會轉化為相應的高級醇。因此，在乙醇生成的同時也有高級醇生成。

表2 紅曲霉在兩種培養(yǎng)基中產高級醇的比較

2.3 氟化鈉對紅曲霉乙醇發(fā)酵的影響

2.3.1 氟化鈉添加量對紅曲霉乙醇發(fā)酵的影響

氟化鈉是一種常見的糖酵解抑制劑，對糖酵解途徑中的丙酮酸激酶具有較強的抑制效果。在丙酮酸激酶的催化作用下，磷酸烯醇式丙酮酸的磷酰基團轉移到ADP上，轉變?yōu)锳TP形式的自由能，同時磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸，這一步反應不可逆。因

此，丙酮酸激酶是整個糖酵解途徑的限速酶。實驗通過添加氟化鈉來抑制紅曲霉的乙醇發(fā)酵，測定糖酵解產物丙酮酸的質量濃度，分析紅曲霉的糖酵解途徑對乙醇合成的作用。

從表3可知，添加氟化鈉的實驗組中，實際乙醇產量均低于對照組。隨著添加的氟化鈉的濃度增加，乙醇產量逐漸降低，糖利用率逐漸降低，酒精發(fā)酵效率逐漸降低。這說明，添加氟化鈉對紅曲霉乙醇發(fā)酵起到了抑制作用。且添加的濃度越大，抑制作用越明顯。表明氟化鈉對于糖酵解途徑中丙酮酸激酶的抑制作用，嚴重地阻礙了EMP途徑的代謝通路，抑制了乙醇的合成，從而間接證明了紅曲霉的乙醇代謝也是經過了該途徑。

表3 氟化鈉添加量對紅曲霉乙醇產量的影響

從表4可知，添加氟化鈉的實驗組中，高級醇產量均低于對照組。隨著添加的氟化鈉的濃度的增加，高級醇產量逐漸降低。當氟化鈉終濃度大于0.01 g/L時，5種高級醇的總量出現(xiàn)了明顯的降低。

表4 氟化鈉添加量對紅曲霉高級醇產量的影響

從圖4可知，氟化鈉的添加對代謝中間產物丙酮酸的合成有明顯的抑制作用。由于丙酮酸激酶控制著EMP途徑最終轉化丙酮酸的關鍵性反應。添加了氟化鈉后，丙酮酸濃度下降，合成的氨基酸含量下降，進而合成的高級醇含量下降。當丙酮酸的合成受到抑制時，紅曲霉的自身生長并未全部受到抑制，這說明仍有少量丙酮酸進入到了TCA循環(huán)，并完成徹底的分解，提供能量。因此并未嚴重影響紅曲霉菌體生長。

圖4 添加氟化鈉對紅曲霉的丙酮酸濃度和菌體干重的影響Fig.4 Effect of sodium fluoride on pyruvate concentration and dry weight of myceliaof Monascus ruber MR9

2.3.2 分階段添加氟化鈉對紅曲霉乙醇發(fā)酵的影響

從表5、表6可知，在紅曲霉發(fā)酵的不同階段添加氟化鈉，對乙醇和高級醇的產量具有明顯不同的影響。在前期添加，會對紅曲霉的乙醇和高級醇產量產生較強的抑制作用，導致乙醇和5種高級醇產量遠低于對照組。而在后期添加時，其對乙醇和高級醇合成的抑制作用就會逐漸減弱。在靜置發(fā)酵第4天時加入氟化鈉，實驗組中乙醇和高級醇的產量幾乎與對照組一樣。說明此時發(fā)酵已經完成，此時添加抑制劑，對最終乙醇產量不會產生太大影響。

表5 不同時間添加氟化鈉對紅曲霉乙醇、丙酮酸產量的影響

表注：ck：不添加氟化鈉，對照組；a：在接種子液時添加；b：好氧培養(yǎng)1天時添加；c：靜置發(fā)酵1天時添加；d：靜置發(fā)酵2天時添加；e:靜置發(fā)酵3天時添加；f：靜置發(fā)酵4天時添加。

表6 不同時間添加氟化鈉對紅曲霉高級醇產量的影響

表注：ck：不添加氟化鈉，對照組；a：在接種子液時添加；b：好氧培養(yǎng)1天時添加；c：靜置發(fā)酵1天時添加；d：靜置發(fā)酵2天時添加；e:靜置發(fā)酵3天時添加；f：靜置發(fā)酵4天時添加。

由于加入了氟化鈉，造成糖酵解過程受阻，產生的能量減少，進而TCA循環(huán)受到影響，草酰乙酸產量下降，生成正丙醇的前體物質——蘇氨酸產量減少，因此正丙醇產量下降。丙酮酸產量下降，因此纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸合成減少，導致異丁醇、異戊醇、活性戊醇產量下降。磷酸烯醇式丙酮酸產量下降，苯丙氨酸的合成減少，苯乙醇產量下降[12]。

本實驗結果表明發(fā)酵前期對紅曲霉的乙醇合成尤為重要。如果此時添加氟化鈉，會導致糖酵解過程受阻，無法合成丙酮酸，進而會對乙醇合成產生嚴重影響。

3 結論

糖酵解抑制劑氟化鈉會在一定程度上影響紅曲霉的菌體生長及乙醇、高級醇的合成。由此可推測紅曲霉的乙醇合成與EMP途徑相關。當EMP途徑嚴重受阻時，紅曲霉將無法進行丙酮酸和乙醇的合成。通過分階段添加糖酵解抑制劑測定乙醇產量時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期對于紅曲霉的乙醇合成與菌體生長尤為重要。同時，在其他研究中發(fā)現(xiàn)，以火龍果汁、葡萄汁作為底物進行發(fā)酵時，紅曲霉發(fā)酵液酒度可達到7%～9%(v/v)，與釀酒酵母發(fā)酵水平相當?？稍诮窈笱芯恐羞M一步挖掘紅曲霉產乙醇的潛能。

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Effects of the glycolytic inhibitor on ethanol fermentation byMonascus

LI Chen-yang， ZHAO Jing， SHEN Yan-hua， ZHAO Shu-xin

(Tianjin University of Science and Technology, The Ministry of Education Key Laboratory of Industrial Fermentation Microorganisms,Tianjin 300457,China)

Hongqu is a Chinese traditional fermented product in many regions. Hongqu has been used for brewing rice wines which have a long history and some of them belong to China’s intangible cultural heritage, such as Zhejiang jinhua rice wine, Fujian rice wine, and so on. The traditional Hongqu used for brewing rice wines mainly containsMonascus,Saccharomycescerevisiae, and other bacteria. Early researches indicated thatMonascuscould synthesize ethanol. In this study, the ethanol metabolic pathway involved inMonascuswas studied. Results indicated thatMonascuscould synthesize ethanol with glucose as substrate. Sodium fluoride (Glycolytic inhibitor) inhibited the production of biomass, ethanol, and higher alcohols during the ethanol fermentation byMonascusat a certain level. It could predicate that the growth and ethanol fermentation byMonascuswere based on the glycolytic pathway. When Embden-Meyerhof-Parnas pathway was seriously inhibited,Monascuscould not synthesize pyruvic acid and ethanol.

Monascus； ethanol； higher alcohols； glycolytic inhibitor； pyruvate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704009

碩士研究生。

2016-11-01，改回日期：2016-11-25