杜海,杜小威,趙景龍,張鑫,徐巖

1(江南大學, 釀酒科學與酶技術中心, 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西 汾陽，032205)

貯存過程中大曲原核微生物多樣性及土味素含量變化規(guī)律

杜海1,杜小威2,趙景龍2,張鑫2,徐巖1*

1(江南大學, 釀酒科學與酶技術中心, 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西 汾陽，032205)

通過對不同貯存時期大曲的微生物群落結構的分析，進一步闡述了大曲的貯存過程的必要性。采用MiSeq高通量測序方法，鑒定出原核微生物119個屬。其3種大曲相對豐度靠前的優(yōu)勢菌屬主要為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬等。隨著貯存時間的推移，3種大曲的物種多樣性都處于上升趨勢。在各個階段高溫曲的物種豐度和多樣性都高于清茬曲和紅心曲，說明高溫曲的制曲工藝使得微生物生長更活躍。分析3種大曲中鏈霉菌與土味素的含量變化趨勢，在貯存3個月時，兩者的含量相對較低。因此，從異味控制的角度來看，大曲貯存3個月左右的時間更利于白酒風味的形成。

大曲貯存；MiSeq測序；微生物群落；鏈霉菌

中國白酒歷史久遠，是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的蒸餾酒。大曲在白酒釀造過程中有著舉足輕重的地位，其中棲息著豐富的微生物種屬(比如細菌、酵母及霉菌等)[1]，其作為白酒釀造過程中微生物及生物酶的有效載體，在白酒釀造中起著糖化、發(fā)酵、生香的作用，因此，大曲質(zhì)量的好壞會直接影響到白酒的產(chǎn)量以及質(zhì)量。大曲是以大麥、小麥、豌豆等為原料，經(jīng)過粉碎，加水混捏，壓成曲醅，形似磚塊，大小不等，讓自然界各種微生物富集生長而制成[2]。

清茬、紅心、高溫這3種大曲在培養(yǎng)的過程中存在差異，具體來說是3種曲在培養(yǎng)溫度上各有不同[3]。因而其生化性能與微生物的數(shù)量也有較大的差異性，而這些差異與工藝是相一致的。據(jù)目前的研究，在貯存3個月后，清茬曲的糖化力、液化力和蛋白酶均高于另兩種大曲。而紅心曲中的細菌含量最高，清茬和高溫曲中總的酵母和霉菌的含量比較高[4]。3種大曲若單獨發(fā)酵，出酒率是高溫曲最高，清茬曲次之，紅心曲最低。而將3種大曲按照一定比例混合(3∶3∶4)，則出酒率會得到提高。3種大曲混合可以取長補短，菌種較多后，各種營養(yǎng)的成分才能盡可能地被各種微生物利用，進而代謝出各種產(chǎn)物，提高出酒率的同時也能提高其質(zhì)量和風味[5]。同時，大曲白酒中除香氣成分以外，還存在著許多像糠嗅味、澀苦酸等常見的不愉快氣味[6]。其中，糠嗅味則在清香型白酒中表現(xiàn)更為突出。研究表明，產(chǎn)生這一異味的源頭為大曲中鏈霉菌代謝的土味素[7]。研究制曲過程分析土味素產(chǎn)生菌變化規(guī)律以及其他微生物之間的相互作用，對于白酒風味提升以及品質(zhì)穩(wěn)定性的提高有重要意義。

根據(jù)文獻記載，PCR-DGGE技術在21世紀初開始運用到大曲微生物的研究中，使人們更近一步地認識大曲中的微生物的分布[8]。CHEN等人采用PCR-DGGE技術，共檢測到了11株細菌、9株桿菌和7株真菌，其中優(yōu)勢菌群有枯草桿菌和米曲霉[9]。利用PCR-DGGE技術來研究大曲中的微生物，能夠提供微生物群落中比較詳細的種類信息并且可以同時去分析多個樣品，但弊端是實驗操作很繁瑣，對微生物多樣性的認識比較有限[10-11]。近幾年，因為高通量測序技術的發(fā)展，在微生態(tài)學研究中開始大規(guī)模地使用二代測序技術。ZHANG等人利用二代測序的技術，分析了清香型白酒3種大曲的微生物結構，為生產(chǎn)時大曲的添加比例提供了可靠依據(jù)[12]。但新曲中微生物種類豐富且生物量較高，導致投入生產(chǎn)的酒醅發(fā)酵前升溫迅速，總酸度高。因此，出房大曲必須貯存于通風干燥的曲庫。在此過程中，隨著貯存時間的推移，3種大曲中所含微生物的結構也在不斷發(fā)生變化。目前關于這些微生物結構的動態(tài)變化報道還相對比較少。

本研究以汾酒釀造用大曲為研究對象，通過提取大曲微生物總DNA、PCR擴增等預處理，以MiSeq高通量測序剖析大曲貯存過程中微生物群落結構變化；對微生物群落組成進行比較研究，以此分析各功能菌的變化趨勢，從而進一步解析清香型大曲功能微生物，探究大曲最合適的貯存時間。

1 材料與方法

1.1 大曲樣品

實驗大曲樣品取自某清香型白酒廠所產(chǎn)清茬曲、紅心曲和高溫曲，3種大曲均按照出房、貯存1個月、3個月和5個月一共4個時間點分別采集。為了保證取樣的科學性以及均一性，出房時在5處取樣，貯存1個月、3個月和5個月則隨機選取3塊大曲做平行樣并放置在-20 ℃進行保藏。

1.2 樣品前處理

取7 g大曲樣品，加入20 mL無菌的0.1 mol/L PBS緩沖液(0.057 7 mol/L Na2HPO4，0.042 3 mol/L NaH2PO4)將樣品懸浮，再加入玻璃珠平放漩渦振蕩3 min使其充分混合。將混合樣300×g轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，沉淀用上述PBS緩沖液重復洗滌3次，再次離心后收集全部的上清液。上清液于10 000×g離心15 min，收集細胞沉淀。用5 mL PBS緩沖液將上述沉淀重復洗滌3次，直到洗液干凈呈無色狀態(tài)，再10 000×g離心10 min重新收集細胞沉淀。

1.3 大曲宏基因組提取

采用玻璃珠細胞破碎儀破碎細胞，苯酚氯仿抽提方法提取窖泥細菌基因組，具體方法參照文獻[14]。

1.4 IlluminaMiseq測序及序列分析

利用引物對338F (5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GTGGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)，對上述大曲基因組進行PCR擴增，該對引物針對細菌16S rRNA基因序列中的V3-V4可變區(qū)進行擴增。將合并的PCR產(chǎn)物按照說明書TruSeq? DNA Sample Preparation Guide中的Low Sample (LS) Protocol進行文庫制備，然后在Illumina平臺上進行雙端測序(2×250 bp)。然后將所得原始序列按照Ren等人的方法進行序列質(zhì)量控制處理最終得到有效序列。本實驗用QIIME′s uclust程序?qū)⑾嗨贫葹?7%有效序列歸為一個OTU并確定每個OTU的代表序列。利用QIIME軟件計算酒醅微生物群落的α-多樣性信息，包括Shannon及Chao1指數(shù)?；赪eighted UniFrac距離對不同酒醅樣品中微生物群落進行主坐標軸分析(PCoA)。將每個OTU的代表序列與Ribosomal Database Project (RDP)在線數(shù)據(jù)庫進行比對，選取置信度為80%的閾值對上述序列進行分類，進而得到每個OTU的分類水平，即門、綱、目、科及屬水平。

2 結果與討論

采用MiSeq測序技術結合PCR技術對3種大曲樣品進行定性定量分析，將測序結果所得到的原始的序列按照REN[15]等人的方法進行一個初步的處理，來控制質(zhì)量，進而得到有效的序列。然后將每個OUT所代表的序列在NCBI的在線數(shù)據(jù)庫里進行比對，選擇匹配度最高的比對結果，進而進行分類，得到門、綱、目、科、屬5個水平。基于以上處理結果，探究其在不同貯存時期微生物群落的變化，以此來區(qū)分3種大曲，以及每種大曲在不同時期的特點。

2.1 三種大曲貯存過程中微生物群落結構差異

為了更加全面地揭示3種大曲在貯存過程中微生物群落的組成以及多樣性信息，本研究采用IlluminaMiSeq技術，對清茬、紅心和高溫曲不同貯存時間下微生物群落結構進行了分析。圖1為3種大曲在不同貯存時間下針對原核微生物測序結果的稀釋曲線。該曲線相對來說趨于平緩，說明本研究測序結果可以比較全面的覆蓋應有的物種。

圖1 不同貯存時間3種大曲中原核微生物測序稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of prokaryotic community in Daqu at different storage periods

表1中分析了3種大曲細菌的Chao1和Shannon指數(shù)。表中顯示，隨著貯存時間的推移，原核微生物多樣性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。清茬曲和紅心曲在貯存3個月的時候物種豐度和多樣性達最高值，高溫曲則在貯存5個月的時候達到最高。說明大曲貯存過程中微生物的群落多樣性及結構在不斷地進行調(diào)整變化。生物多樣性與后期發(fā)酵風味的產(chǎn)生密切相關，各菌種相互平衡、協(xié)同作用，更利于發(fā)酵的進行。故而選擇大曲適宜的貯存時間，同時要密切關注微生物結構的多樣性，在多樣性達到較高水平且穩(wěn)定的時候較為合適。此外，在各個階段高溫曲的物種豐度和多樣性都高于清茬曲和紅心曲。說明高溫曲的制曲工藝相對來說更適合多種微生物的生長繁殖。

表1 不同貯存時間3種大曲中原核微生物多樣性分析

圖2為3種大曲不同的貯存時間下原核微生物群落的PCoA分析。分析結果顯示，不同大曲樣品個體之間菌群結構的存在較大差異。但前期與后期大曲樣品的細菌群落能分別較好在不同象限聚集在一起。其中整體規(guī)律為：清茬曲與高溫曲的菌群結構較為相似。這兩種大曲貯存起始時期樣品可以較好地聚到一起。在貯存后期，3種大曲的樣品有相似的菌群結構。說明3種大曲貯存過程中變化相對來說比較明顯，存在差異性。紅心大曲中存放過程中微生物結構變化較小。貯存過程中，物種的差異性逐漸減少對于大曲品質(zhì)的控制和發(fā)酵優(yōu)化的進行有著很重要的意義。

圖2 三種大曲不同貯存時期原核微生物PcoA分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of prokaryotic microorganisms in three kinds of Daqu at different storage periods注：QC、HX、GW分別為清茬曲、紅心曲和高溫曲的簡稱；S0m表示貯存0個月即出房、S1m表示貯存1個月，S3m表示貯存3個月，S5m表示貯存5個月；S0m后數(shù)字為樣品編號。

2.2 三種大曲中原核微生物結構變化趨勢

從圖3可知，從3種大曲中鑒定出9個門，其中最主要有3個門，分別為：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacillus)。其他的如擬桿菌門(Bacteroidetes)等雖然也存在但含量很低。其中，厚壁菌門在3種大曲中的含量都是最高的。其在紅心曲和高溫曲中呈現(xiàn)減少的趨勢，在清茬曲中總體呈現(xiàn)上升趨勢。

變形菌門在清茬和紅心曲中的含量總體來說比在高溫曲中多，在清茬曲中總體呈現(xiàn)增加的趨勢；在紅心曲中總體呈下降趨勢；而在高溫曲中普遍較低，含量相比來說比較穩(wěn)定。放線菌門與變形菌門的演替趨勢正好相反，在高溫曲中的含量比其他兩個曲中的都要高，除在5個月時含量有所降低外，其他幾個時期都比較穩(wěn)定。

根據(jù)IlluminaMiSeq測序技術鑒定出的細菌一共有119個屬，分別屬于9個門，其3種大曲相對豐度靠前的優(yōu)勢菌屬主要為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬等。選定相對豐度前20的屬分析其變化趨勢。隨著貯存時間的推移，3種大曲中的微生物群落結構也各不相同。在清茬曲中，呈上升趨勢的有明串珠菌屬(Leuconostoc)?？傮w呈下降趨勢的有葡萄球菌屬(Staphylococcus)，魏斯氏菌屬(Weissella)和鏈霉菌屬(Streptomyces)；芽孢桿菌屬(Bacillus)含量先降低后升高，貯存1個月時最低。一些菌屬如短桿菌屬(Brachybacterium)變化并不明顯。在紅心曲中，芽孢桿菌屬先增加后減少，在貯存1個月的時候相對豐度最高；葡萄球菌屬總體呈現(xiàn)降低的趨勢，在出房時含量最高；乳酸菌屬和魏斯氏菌屬總體上呈現(xiàn)上升趨勢。在高溫曲中，芽孢桿菌先減少后增加，貯存1個月的時候含量相對較低，而魏斯氏菌屬正好相反，先增加后減少，在1個月的時候含量最高。乳酸菌屬持續(xù)增加后趨于穩(wěn)定。葡萄球菌屬持續(xù)降低后趨于穩(wěn)定。短桿菌屬總體呈現(xiàn)上升趨勢。

乳酸菌廣泛存在于自然界中[13]。在白酒發(fā)酵過程中，可賦予酒獨特的香氣和口味。同時可以控制酒醅酸度和升溫，如果控制得當可以使酒醅的出酒率穩(wěn)定。同時，乳酸菌生成的乳酸，以及通過與乙醇發(fā)生酯化反應再生成乳酸乙酯，可以賦予白酒獨特的風格。當然，如果乳酸菌過多也會出現(xiàn)使酒質(zhì)發(fā)悶、苦澀等缺點。芽孢桿菌屬是白酒發(fā)酵中另一個主要的細菌屬。芽孢桿菌屬繁殖很快，在水分和氧氣較多的軟曲塊中尤其迅速。而芽孢桿菌屬中微生物普遍具有水解淀粉和分解蛋白質(zhì)的能力。在發(fā)酵中起著增香、特別是改善汾酒后味的重要作用[14]。

總體來說，3種大曲細菌分布逐漸趨于平衡，隨著貯存時間的推移，一些出房時相對豐度很高的菌屬在逐漸降低，而相對豐度較低的則在逐步上升。說明各大曲的細菌分布隨貯存時間的推移趨于合理，更利于后期發(fā)酵的進行。

2.3 探尋大曲中異味物質(zhì)土味素與鏈霉菌相互關系

在白酒中，除了有各種香氣成分以外，還存在著很多，比如土霉味、澀苦味等常見的一些不愉快的氣味，這其中土霉味在清香型白酒中表現(xiàn)尤為突出。經(jīng)研究表明，產(chǎn)生這種氣味的物質(zhì)主要為大曲帶入的土味素(geosmin，GSM)，且產(chǎn)生土味素的主要功能微生物是鏈霉菌[7,15]。因此，研究清茬、紅心和高溫3種曲在不同貯存時期鏈霉菌相對豐度的變化趨勢，可更合理的選擇優(yōu)質(zhì)大曲，減少釀造過程中土味素的產(chǎn)生。圖4為根據(jù)測序結果比對出的鏈霉菌的相對豐度以及檢測到的3種大曲在不同貯存時期土味素含量的變化趨勢。

由圖4可以看出，在清茬曲中出房時鏈霉菌和土味素的含量均很高，隨著貯存時間的推移慢慢降低，后稍有提高，在貯存3個月的時候土味素濃度最低，鏈霉菌含量也較低；在紅心曲中，鏈霉菌和土味素先增加后減少，后又增加，在貯存3個月的時候兩者含量相對來說比較低；在高溫曲中，鏈霉菌基本呈現(xiàn)出遞增趨勢，土味素總體呈現(xiàn)出遞減的趨勢，且在貯存3個月的時候濃度最低，而此時鏈霉菌含量相對來說也不高，因此貯存3個月的時候兩者含量相對來說比較低。

圖4 清茬曲(a)、紅心曲(b)和高溫曲(c)鏈霉菌與土味素(GSM)含量S0m表示貯存0個月即出房、S1m表示貯存1個月，S3m表示貯存3個月，S5m表示貯存5個月Fig.4 Contents of Streptomyces and Geosmin (GSM) in Qingcha Qu (a), Hongxin QU (b) and Gaowen Daqu (c)

綜合上述分析，鏈霉菌與土味素在誤差允許的范圍內(nèi)基本呈現(xiàn)出正相關的關系，即土味素的濃度隨鏈霉菌含量的增加而增加。結合3種大曲中兩者的變化趨勢，基本選定在大曲貯存期大于3個月的時候，鏈霉菌和土味素的含量相對較低，有利于降低釀造體系中土霉異味。

3 結論

3種大曲在不同貯存時期原核微生物的組成均存在差異性。高溫曲中的乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬的含量相對來說高于清茬和紅心。其3種大曲相對豐度靠前的優(yōu)勢菌屬主要為明串珠菌屬、葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、鏈霉菌屬、乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬等。從微生物的富集以及平衡的角度來看，大曲貯存1～3個月左右的時間，可以為后續(xù)正常的發(fā)酵提供較為合適的動力和條件，更有利于釀造優(yōu)質(zhì)白酒。

大曲除了會為白酒發(fā)酵提供微生物外，也會對白酒的風味產(chǎn)生一定的影響。鏈霉菌產(chǎn)生的土味素是清香型白酒中土霉味的主要來源。分析3種大曲中鏈霉菌與土味素的含量變化趨勢，在貯存3個月左右的時間時，兩者的含量相對較低。因此，從異味風味控制的角度來看，大曲貯存3個月左右的時間更利于異味物質(zhì)及其微生物的減少。

本研究利用高通量測序技術分析了清茬曲、紅心曲和高溫曲貯存過程中的微生物群落結構和演變規(guī)律。同時分析了影響白酒風味的土味素與其功能微生物鏈霉菌的相互關系，并探尋了大曲貯存的最適時間。但研究僅針對大曲中部分典型的功能微生物相對豐度變化趨勢進行了定性分析，還需要進一步的完善和探究大曲中部分功能微生物對發(fā)酵產(chǎn)生的具體影響。

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Prokaryotic microbial diversity and geosmin content in the storage process ofDaqu

DU Hai1， DU Xiao-wei2， ZHAO Jing-long2， ZHANG Xin2， XU Yan1*

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Center for Brewing Science and Enzyme Technology, Wuxi, Jiangsu 214122, China) 2(Shanxi Xinghuacun Fen Liquor Technology Center, Fenyang, Shanxi 032205, China)

The necessity of storage ofDaquwas clarified by analyzing microbial community structure ofDaquduring different storage periods. 119 genera of prokaryotic microbe were identified using the method of MiSeq high-throughput sequencing. Dominant microbes which have a relatively higher abundance in three kinds ofDaqumainly wereLactobacillus,Bacillus,Leuconostoc,Weissella,Streptomyces,Brevibacteriumetc. Species diversity of three kinds ofDaqupresented a rising tendency as time goes on. Species diversity and abundance of GaowenDaquwere higher than those of QingchaQuand HongxinQu. It indicated that the craft process of GaowenDaquwas more suitable for the growth of microbes. Both the content of geosmin and abundance ofStreptomycesin the three kinds ofDaquwere found obviously lower in the third month of storage compared with the initial stage. Therefore,Daqustoring over three month was conductive to the control of off-odor.

storage ofDaqu; MiSeq sequencing; microbial community; streptomyces

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704001

博士(徐巖教授為通訊作者，E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金項目(31501469,31530055)；江蘇省自然科學基金項目(BK20150143)；學科人才引進計劃(111-2-06)中央高?；究蒲谢?JUSRP11537)；中國白酒“3C”計劃

2016-10-15，改回日期：2016-11-16