張小露，高永峰

(1平頂山市第二人民醫(yī)院，河南平頂山467002；2河南省眼科研究所 河南省立眼科醫(yī)院)

增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患眼玻璃體、增生膜組織miR-195表達(dá)及意義

張小露1，高永峰2

(1平頂山市第二人民醫(yī)院，河南平頂山467002；2河南省眼科研究所 河南省立眼科醫(yī)院)

目的 探討miR-195在增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制。方法 選取PDR患者56例(觀察組)、特發(fā)性黃斑裂孔患者30例(對(duì)照組)，均為單側(cè)發(fā)病。兩組均接受常規(guī)玻璃體切割術(shù)，觀察組術(shù)中采集玻璃體及視網(wǎng)膜前增生膜組織，對(duì)照組采集玻璃體及內(nèi)界膜組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組玻璃體和膜組織miR-195和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA相對(duì)表達(dá)量，Western blotting法檢測(cè)兩組膜組織HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量，并分析觀察組玻璃體、膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果 觀察組玻璃體及膜組織miR-195相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.01)。觀察組膜組織HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.94±0.11，對(duì)照組為0.58±0.09，兩組比較P<0.05。觀察組玻璃體及膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.369、-0.508，P均<0.05)。結(jié)論 PDR患眼玻璃體及增生膜組織中miR-195表達(dá)均降低，其可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控HMGB1表達(dá)而參與PDR的發(fā)生、發(fā)展。

增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變；玻璃體；增生膜組織；微小RNA-195；高遷移率族蛋白B1

增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)是2型糖尿病患者常見的一種微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者視力喪失甚至失明的重要原因[1]，目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，以下稱miRNA)為廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守短小RNA，在細(xì)胞增殖、 分化、 凋亡、 免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNAs參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與發(fā)展[3]，其中miR-195可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)而減少腫瘤組織中微血管的生成[4,5]。本研究觀察了PDR患眼玻璃體及視網(wǎng)膜前增生膜組織中miR-195的表達(dá)變化，并探討其在PDR發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年5月～2016年5月于平頂山市第二人民醫(yī)院眼科擇期行玻璃體切割術(shù)的PDR患者56例(均為單側(cè)發(fā)病，觀察組)，男35例、女21例，年齡42～71(54.6±9.5)歲，糖尿病病程5～20(11.8±4.1)年；合并其他疾病情況：糖尿病腎病15例，大血管病變7例；根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)制定的分期標(biāo)準(zhǔn)[6]：Ⅴ期34眼、Ⅵ期22眼。納入標(biāo)準(zhǔn)：①2型糖尿病所致PDR；②反復(fù)出現(xiàn)玻璃體積血，未經(jīng)藥物治療或經(jīng)藥物治療效果不佳，B超檢查示視網(wǎng)膜前機(jī)化膜形成和(或)出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離；③未出現(xiàn)明顯玻璃體積血，但B超、檢眼鏡或光相干斷層掃描檢查示眼底出現(xiàn)增生膜和(或)出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離。排除標(biāo)準(zhǔn)：①空腹血糖>8 mmol/L或合并嚴(yán)重高血壓者；②有玻璃體視網(wǎng)膜或其他眼部手術(shù)史者；③接受抗新生血管藥物治療者；④其他因素所致視網(wǎng)膜增生、視網(wǎng)膜血管性疾病者；⑤合并惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及急慢性感染者。同期選擇擇期行玻璃體切割術(shù)的特發(fā)性黃斑裂孔患者30例(均為單側(cè)發(fā)病，對(duì)照組)，男16例、女14例，年齡40～72(55.6±9.8)歲，排除合并其他眼部疾病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及急慢性感染者。兩組性別、年齡具有可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 玻璃體和膜組織miR-195、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。患者均接受常規(guī)玻璃體切割術(shù)，于灌注前使用玻璃體切割頭，抽取玻璃體0.6 mL，置于微量離心管中；同時(shí)術(shù)中留取觀察組視網(wǎng)膜前增生膜和對(duì)照組內(nèi)界膜組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ山M玻璃體或膜組織，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，TRIzol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，以A260/A280≥1.80視為合格樣品。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用PCR試劑盒(美國(guó)Invitmgen公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-195、HMGB1及內(nèi)參引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-195引物：上游引物：5′-GCACGGTAGCAGCACAGAAA-3′，下游引物：5′-CACTTCCTCAGCACTTGTTGGTAT-3′，引物長(zhǎng)度126 bp。 內(nèi)參U6引物：上游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′， 引物長(zhǎng)度318 bp。HMGB1引物：上游引物：5′-GAGCATAAGAAGAAGCACCCAGAT-3′，下游引物：5′-GGGCGATACTCAGAGCAGAAG-3′，引物長(zhǎng)度399 bp。內(nèi)參β-actin引物：上游引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，引物長(zhǎng)度317 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、1 min；92 ℃、30 s，58 ℃、30 s，75 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算兩組玻璃體和膜組織miR-195、HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 膜組織HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取兩組患眼膜組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用BCA法對(duì)蛋白純度進(jìn)行檢測(cè)。取20 μg蛋白樣品，沸水中煮5 min使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液封閉過(guò)夜，加入一抗兔抗鼠HMGB1多克隆抗體(1∶2 000)，室溫孵育120 min，TBST清洗3次；加入二抗室溫孵育60 min，TBST清洗3次。采用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)LabWork 4.0軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值的比值計(jì)算HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組玻璃體miR-195、HMGB1 mRNA表達(dá)比較 觀察組玻璃體miR-195相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組玻璃體miR-195、HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 兩組膜組織miR-195、HMGB1 mRNA表達(dá)比較 觀察組膜組織miR-195相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.01)。見表2。

表2 兩組膜組織miR-195、HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.3 兩組膜組織HMGB1蛋白表達(dá)比較 觀察組膜組織HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.94±0.11，對(duì)照組為0.58±0.09，兩組比較P<0.05。

2.4 miR-195與HMGB1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 觀察組玻璃體和膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.369、-0.508，P均<0.05)。 3 討論

PDR發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，可能與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、自由基生成、糖基化終末產(chǎn)物堆積、二酰甘油-蛋白激酶C系統(tǒng)活化等多種病理過(guò)程有關(guān)[7,8]。糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清VEGF水平顯著升高，且與病變嚴(yán)重程度有關(guān)[9]。而miR-195與腫瘤組織中微血管生成有關(guān)[10]，且可抑制VEGF表達(dá)[11]。因此，推測(cè)miR-195表達(dá)變化可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關(guān)。本研究顯示，觀察組玻璃體及視網(wǎng)膜前膜組織miR-195相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明PDR患眼玻璃體和視網(wǎng)膜前增生膜組織中miR-195表達(dá)降低，可能與PDR的發(fā)生有關(guān)。

HMGB1作為維持核小體結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的非染色體核蛋白，是一種新型的促炎細(xì)胞因子，在多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變微血管損傷中發(fā)揮重要作用，且參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[13]；釋放到細(xì)胞外的HMGB1可觸發(fā)炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)血管新生[14]；HMGB1可通過(guò)升高VEGF表達(dá)而促進(jìn)缺血組織中的血管新生[15]。因此推測(cè)，HMGB1可能參與了PDR的炎癥反應(yīng)及血管生成。本研究觀察組玻璃體及膜組織HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，膜組織HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量亦高于對(duì)照組，說(shuō)明HMGB1表達(dá)降低與PDR的發(fā)生有關(guān)。有研究指出，HMGB1是miR-195潛在的靶基因[16]。本研究觀察組玻璃體和膜組織中miR-195與HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)，miR-195可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控HMGB1的表達(dá)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)及血管生成，從而參與PDR的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，PDR患眼玻璃體和增生膜組織中miR-195表達(dá)降低，其可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控HMGB1表達(dá)而參與PDR的發(fā)生、發(fā)展，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。

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河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(142102310429)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.025

R774.1

B

1002-266X(2017)16-0074-03

2016-10-17)