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        膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞外源基因瞬時轉(zhuǎn)染方法的選擇

        2017-06-19 19:27:15呼格吉樂高乃康劉秉春袁建龍
        山東醫(yī)藥 2017年16期
        關(guān)鍵詞:脂質(zhì)體外源膠質(zhì)瘤

        呼格吉樂,高乃康,劉秉春,袁建龍

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,呼和浩特010050)

        膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞外源基因瞬時轉(zhuǎn)染方法的選擇

        呼格吉樂,高乃康,劉秉春,袁建龍

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,呼和浩特010050)

        目的 選擇一種將外源基因瞬時轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染方法。方法 以去內(nèi)毒素真核表達(dá)載體DsRed2為外源基因,分別采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法以及電轉(zhuǎn)染法,將不同濃度的DsRed2質(zhì)粒(0.25、0.5、1.0 μg)轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(以下稱膠質(zhì)瘤細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量均為1.0×105個)。熒光顯微鏡下采用可見光、紅色熒光濾鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及紅色熒光蛋白表達(dá),紫外光濾鏡下觀察細(xì)胞核Hocest33342染色情況,計算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果 三種方法均能將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,紅色熒光蛋白表達(dá)效果均良好。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)基本正常,但表達(dá)紅色熒光蛋白與未表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞形態(tài)差異較大。相同質(zhì)粒濃度下,電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染后表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量多于脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法。隨著質(zhì)粒濃度的升高,脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法和電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率逐漸升高。相同質(zhì)粒濃度下,電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高于脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法(P均<0.01)。結(jié)論 電轉(zhuǎn)染法對外源基因瞬時轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高,并呈質(zhì)粒濃度依賴性。

        膠質(zhì)瘤細(xì)胞;質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染方法;電轉(zhuǎn)染法;轉(zhuǎn)染效率

        膠質(zhì)瘤是成人顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,占顱內(nèi)腫瘤的50%~60%,患者預(yù)后較差,生存時間短[1,2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,靶向治療尤其是基因治療成為當(dāng)今膠質(zhì)瘤治療的研究熱點[3,4]。基因靶向治療基礎(chǔ)研究中需要將外源目的基因?qū)爰?xì)胞或者細(xì)胞基因組,基因轉(zhuǎn)染效率決定了后續(xù)實驗?zāi)芊耥樌M(jìn)行[5,6]。若轉(zhuǎn)染效率低,必須對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步篩選,獲得純度較高的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,以減少未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對實驗結(jié)果的干擾。常用的外源基因?qū)敕椒ㄓ兄|(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電轉(zhuǎn)染法、慢病毒轉(zhuǎn)染法等,各種方法均有較好的轉(zhuǎn)染效果;其中慢病毒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率最高[7,8],但其試劑及耗材較昂貴,且需要特殊的安全等級實驗室,以及生物安全性問題,限制了該方法在一般生物學(xué)實驗室的應(yīng)用。2015年12月~2016年3月,本研究觀察了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞外源基因瞬時轉(zhuǎn)染的效果?,F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料 細(xì)胞:人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(以下稱膠質(zhì)瘤細(xì)胞)購自中科院上海細(xì)胞庫,保存于液氮中。含有紅色熒光蛋白真核表達(dá)載體的DsRed2菌株由郭旭東教授饋贈,表達(dá)載體含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子,可以驅(qū)動紅色熒光蛋白基因組成型表達(dá)[9]。主要試劑:DMEM/F12、D-PBS、無血清MEM培養(yǎng)基及0.05%胰蛋白酶、抗生素等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自上海Gibco公司,標(biāo)準(zhǔn)FBS購自天津TBD公司,Qiagen去內(nèi)毒素提試劑盒購自北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司,脂質(zhì)體Lipofectamine2000購自美國Invitrigen公司,脂質(zhì)體Viafect購自美國Promega公司。主要儀器:倒置熒光顯微鏡(Ti200)、體視鏡(SMZ1500)均購自日本Nikon公司,CO2培養(yǎng)溫箱購自德國Binder公司,電轉(zhuǎn)染儀(Nepa21 typeⅡ)購自日本Nepa Gene公司。

        1.2 外源基因瞬時轉(zhuǎn)染

        1.2.1 DsRed2質(zhì)粒提取 參照去內(nèi)毒素提試劑盒說明書提取DsRed2質(zhì)粒,采用Thermo Nanodrop分光光度計檢測光密度(OD)值,采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒的純度與完整性。結(jié)果顯示,提取的DsRed2質(zhì)粒OD260/OD280為1.81,DNA濃度為625 ng/μL,符合基因轉(zhuǎn)染條件。

        1.2.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞解凍與復(fù)蘇 將液氮中凍存的膠質(zhì)瘤細(xì)胞迅速放入37 ℃水浴鍋中,持續(xù)晃動細(xì)胞凍存管,使細(xì)胞液體迅速解凍;沒有冰晶以后,將細(xì)胞以500 r/min離心5 min,去上清。將細(xì)胞沉淀用含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行重懸,將細(xì)胞懸液加入90 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)基補(bǔ)齊至10 mL。37 ℃、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng),次日更換液體。結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞解凍復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)、增殖速度等均正常,可用于以下轉(zhuǎn)染實驗。

        1.2.3 DsRed2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 ①脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法:將膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),轉(zhuǎn)染前1天接種至24孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/孔。細(xì)胞融合至約80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體步驟如下:將240 μL無血清MEM培養(yǎng)基與10 μL Lipofectamine2000混合,室溫孵育5 min;將250 μL無血清MEM培養(yǎng)基與DsRed質(zhì)粒(質(zhì)粒用量分別為0.25、0.5、1.0 μg/孔)充分混合,室溫靜置5 min;將二者混合均勻,室溫下靜置30 min。采用PBS溶液將24孔板中的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞清洗3次,然后將混合液慢慢逐滴加入24孔板中,上下?lián)u動培養(yǎng)板,輕輕混勻。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下孵育6 h,吸出原先的培養(yǎng)液,緩緩加入新鮮的DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基。②脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法:參照①的方法接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞,按照脂質(zhì)體Viafect使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,脂質(zhì)體Viafect的轉(zhuǎn)染步驟與脂質(zhì)體Lipofectamine2000相同,轉(zhuǎn)染時使用24孔板,每孔所用脂質(zhì)體體積為10 μL,DsRed2質(zhì)粒用量分別為0.25、0.5、1.0 μg/孔。③電轉(zhuǎn)染法:將膠質(zhì)瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)48 h后,消化、收集細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),采用不無血清MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,最終細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL。將其分為三組,每組DsRed2質(zhì)粒用量分別為2.5、5.0、10 μg。將細(xì)胞與質(zhì)粒混合液100 μL轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中,此時每1×105個細(xì)胞的DsRed2質(zhì)粒用量分別為0.25、0.5、1.0 μg。用手指輕輕敲擊電轉(zhuǎn)杯,確保細(xì)胞均勻分布于電轉(zhuǎn)杯中,注意不要產(chǎn)生氣泡。根據(jù)以往研究中的轉(zhuǎn)染條件[10],調(diào)整參數(shù)為電壓200 V、脈沖時間5 ms、脈沖次數(shù)2次,進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染完畢,電轉(zhuǎn)杯內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)基,輕輕吹吸3次,將細(xì)胞再次混勻。將懸液完全吸出,接種到6孔板中,補(bǔ)加含有血清的培養(yǎng)基。以上實驗均重復(fù)3次。

        1.3 轉(zhuǎn)染效果觀察 轉(zhuǎn)染48 h后,將采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于24孔板,電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于6孔板,每孔分別加入1、5 μL Hocest33342染料(5 mg/mL),37 ℃孵育30 min。分別于100倍倒置熒光顯微鏡下使用可見光、紅色熒光濾鏡、紫外光濾鏡進(jìn)行觀察,每孔選擇5個視野。可見光下觀察細(xì)胞狀態(tài),紅色熒光濾鏡下觀察紅色熒光熒光蛋白表達(dá)情況,紫外光濾鏡下觀察細(xì)胞核Hocest33342染色情況,并進(jìn)行染色細(xì)胞計數(shù),計算轉(zhuǎn)染效率。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞形態(tài)及紅色熒光蛋白表達(dá) 三種方法均能將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,紅色熒光蛋白表達(dá)效果均良好。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)基本正常,但表達(dá)紅色熒光蛋白與未表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞形態(tài)差異較大。隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的升高,三種方法轉(zhuǎn)染后表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量均逐漸增多,以電轉(zhuǎn)染法增多最明顯。相同質(zhì)粒濃度下,電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染后表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量多于脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法。

        2.2 轉(zhuǎn)染效率 隨著質(zhì)粒濃度的升高,脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法和電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率逐漸升高,脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率先升高后降低。相同質(zhì)粒濃度下,電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高于脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法(P均<0.01)。見表1。

        表1 三種方法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比較

        注:與電轉(zhuǎn)染法比較,*P<0.01。

        3 討論

        目前癌癥的靶向藥物研究方向主要為小分子、單克隆抗體、基因藥物等[11]。人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于腦部腫瘤尤其是神經(jīng)腫瘤的基礎(chǔ)研究[6,12],采用轉(zhuǎn)染法將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞對于研究膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制具有重要意義[13,14]。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法為目前使用最多的方法,無需特殊設(shè)備,但是一次性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量較少,需要大量轉(zhuǎn)染時耗費脂質(zhì)體較多,成本大大提高。電轉(zhuǎn)染法一次轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量多,成本相對較低,但是需要前期購買昂貴的電轉(zhuǎn)染儀。不論是電轉(zhuǎn)染還是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染都需要摸索合適的轉(zhuǎn)染條件,尤其是在進(jìn)行基因瞬時轉(zhuǎn)染或者基因表達(dá)干擾實驗時,必須以較高的轉(zhuǎn)染效率為主要目標(biāo)。

        本研究脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法以及電轉(zhuǎn)染法使用的DNA總量不同。由于電轉(zhuǎn)染法一次所需細(xì)胞較多,我們在進(jìn)行電轉(zhuǎn)染時使用的是6孔板進(jìn)行培養(yǎng),每孔細(xì)胞密度為1×106個/mL,是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使用細(xì)胞總量的10倍,因此轉(zhuǎn)染用的DsRed2質(zhì)粒用量也相應(yīng)增加了10倍,但是根據(jù)細(xì)胞濃度進(jìn)行計算后,每1×105個細(xì)胞質(zhì)粒用量均分別控制為0.25、0.5、1.0 μg。本研究中表達(dá)紅色熒光蛋白與未表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞形態(tài)差異較大,可能與外源基因的轉(zhuǎn)入對細(xì)胞本身造成一定影響有關(guān)。因此,為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,在轉(zhuǎn)染目的基因質(zhì)粒的時候,必須以轉(zhuǎn)染空白骨架質(zhì)粒的細(xì)胞作為對照組,而不是以非處理過的細(xì)胞作為對照組。

        Hocest33342染色可使所有的細(xì)胞核在紫外激發(fā)下顯示出藍(lán)色熒光,便于對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。本研究結(jié)果顯示,隨著質(zhì)粒濃度的升高,脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法和電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率逐漸升高,脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率先升高后降低。相同質(zhì)粒濃度下,電轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高于脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體Viafect轉(zhuǎn)染法。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低,可能與本研究使用的脂質(zhì)體不適合轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞有關(guān),與張禾璇等[15]報道相似。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時細(xì)胞狀態(tài)會影響轉(zhuǎn)染效率,細(xì)胞解凍后最好進(jìn)行2次傳代后再行電轉(zhuǎn)染。同時質(zhì)粒濃度和純度也非常重要,需要使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化質(zhì)粒(建議使用Qiagen去內(nèi)毒素提取試劑盒),質(zhì)粒提取完畢后不但要使用分光光度計測定質(zhì)粒DNA濃度,更需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的純度與完整性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后要根據(jù)具體數(shù)量將細(xì)胞鋪到細(xì)胞板中,切忌細(xì)胞密度過高或者過低。優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件的過程中,本研究并未對脂質(zhì)體用量進(jìn)行調(diào)整,僅對質(zhì)粒濃度進(jìn)行了優(yōu)化。主要是因為對于貼壁細(xì)胞而言,按照說明書選擇脂質(zhì)體濃度進(jìn)行實驗也可得到良好的效果,但是脂質(zhì)體在一定程度上對細(xì)胞具有毒性作用,增加脂質(zhì)體用量并不能顯著提高外源基因的轉(zhuǎn)染效率[16],反而會加大實驗成本。

        綜上所述,外源基因瞬時轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞的方法中以電轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率較高,并呈質(zhì)粒濃度依賴性,為后續(xù)實驗選擇高效的外源基因瞬時轉(zhuǎn)染方法提供依據(jù)。

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        內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科技百萬工程(YKD2015KJBW010);內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金資助項目(YKD2012QNX009)。

        袁建龍(E-mail: yjllj123@qq.com)

        10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.013

        R34

        A

        1002-266X(2017)16-0044-03

        2016-06-09)

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