王彥超，鄧蓉蓉，葉亞?wèn)|，席志鵬，康然，謝林

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3泰州市中醫(yī)院)

補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、遷移的影響及其機(jī)制

王彥超1,2，鄧蓉蓉2，葉亞?wèn)|3，席志鵬2，康然2，謝林2

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3泰州市中醫(yī)院)

目的 探討補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖、遷移的影響及其可能的作用機(jī)制。方法 采用全骨髓貼壁法分離提取大鼠BMSCs并進(jìn)行驗(yàn)證。制備補(bǔ)腎活血舒筋方低、中、高濃度含藥血清(1.1、2.2、4.4 g/mL)及空白血清，將大鼠BMSCs隨機(jī)分為含藥血清低、中、高濃度組和空白對(duì)照組，分別加入上述血清。采用CCK-8法檢測(cè)各組增殖能力(以細(xì)胞生存率表示)，Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力(以細(xì)胞遷移數(shù)量表示)，Western blotting法檢測(cè)趨化因子受體4(CXCR4)和NF-κB信號(hào)通路p65蛋白表達(dá)。結(jié)果 各組間細(xì)胞生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。含藥血清高、中濃度組細(xì)胞遷移數(shù)量均高于含藥血清低濃度組、空白對(duì)照組，且含藥血清高濃度組高于含藥血清中濃度組(P均<0.05)。含藥血清高、中、低濃度組與空白對(duì)照組p65、CXCR4蛋白表達(dá)依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。結(jié)論 2.2、4.4 g/mL補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清可促進(jìn)BMSCs遷移，但對(duì)BMSCs增殖無(wú)影響；激活NF-κB信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；補(bǔ)腎活血舒筋方；細(xì)胞遷移；核轉(zhuǎn)錄因子κB；趨化因子受體4；大鼠

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能、自我復(fù)制、靶向歸巢和損傷修復(fù)等特點(diǎn)。研究證實(shí)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)等趨化因子具有調(diào)控MSC歸巢的作用，其與趨化因子受體4(CXCR4)結(jié)合形成的SDF-1/CXCR4軸是促進(jìn)MSC向損傷組織歸巢的重要生物軸[1]，同時(shí)該軸調(diào)控細(xì)胞歸巢的作用受NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[2]。補(bǔ)腎活血舒筋方對(duì)于脊柱退行性變有一定療效[3,4]，且能夠調(diào)節(jié)CXCR4表達(dá)[5]，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)遷移[6]。前期研究顯示，補(bǔ)腎活血舒筋方可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)及椎間盤(pán)退變[7]。本研究觀察了補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清對(duì)大鼠BMSCs增殖、遷移的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 4周齡SD大鼠24只，SPF級(jí)，均為雌性，平均體質(zhì)量80 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物中心提供。主要試劑：MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，兔抗大鼠NF-κB(p65)、CXCR4抗體/羊抗兔遠(yuǎn)紅外二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。主要儀器：流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于瑞士Tecan公司，ODYSSEY雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)LICOR公司。

1.2 大鼠BMSCs提取與鑒定 取4周齡SD大鼠4只，分離雙側(cè)股骨和脛骨，采用全骨髓貼壁法[8]提取BMSCs：將細(xì)胞放置于完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)基)中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液1次。待細(xì)胞在T25培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，以1∶3進(jìn)行傳代，傳至第3代時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，第3～5代細(xì)胞純化程度高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)；傳代后的細(xì)胞呈紡錘形或梭形，細(xì)胞數(shù)目多、排列緊密時(shí)可呈漩渦狀。取第3代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面抗體CD29、CD34、CD45、CD90表達(dá)，結(jié)果顯示其陽(yáng)性率分別為91.77%、85.40%、0.22%、2.20%，證實(shí)該細(xì)胞為BMSCs。

1.3 補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清制備 補(bǔ)腎活血舒筋方中藥組成參照謝林等[3]的研究，取其方藥以純凈水煎煮，將藥液過(guò)濾、濃縮，調(diào)配至1.1、2.2、4.4 g/mL(以生藥量計(jì)算)，分別記為低、中、高濃度。將20只SD大鼠隨機(jī)分為四組，每組5只，分別以1.1、2.2、4.4 g/mL藥液及純凈水灌胃，劑量為2 mL。連續(xù)灌胃14天后采血，血樣靜置2 h后3 000 r/min離心20 min，取上清。

1.4 含藥血清對(duì)大鼠BMSCs增殖、遷移能力影響的觀察

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板。將細(xì)胞分為含藥血清低、中、高濃度組及空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后更換為MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。含藥血清低、中、高濃度組每孔分別加入低、中、高濃度含藥血清10 μL，空白對(duì)照組加入等量空白血清。

1.4.2 細(xì)胞增殖能力 采用CCK-8法。取各組干預(yù)后細(xì)胞，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL后繼續(xù)孵育4 h。采用酶標(biāo)儀在460 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)值，用不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基做空白對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 細(xì)胞遷移能力 采用Transwell小室試驗(yàn)。取處理48 h的各組細(xì)胞，消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，懸于含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中。將Transwell裝置置于培養(yǎng)箱中平衡30 min，上室接種1×105個(gè)細(xì)胞(體積為100 μL)，下室為含100 ng/mL SDF-1α、2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(體積為500 μL)，置于CO2培養(yǎng)箱中12 h。棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后4%中性甲醛固定15 min；結(jié)晶紫染色15 min，棄染色液， PBS清洗2次。用棉簽小心擦掉上室上側(cè)細(xì)胞，再用小刀取下小室的聚碳酯膜，于倒置相差顯微鏡下對(duì)Transwell上室下側(cè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，即細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.5 NF-κB信號(hào)通路p65蛋白、CXCR4蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs，消化處理后以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，予MEM培養(yǎng)基饑餓處理8 h，使其生長(zhǎng)同步化。參照1.4.1的方法進(jìn)行分組處理48 h后收集細(xì)胞。加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，收集并提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液調(diào)整至統(tǒng)一的蛋白質(zhì)濃度，以每道10 μL蛋白上樣。80 V電壓電泳10 min，觀察到溴酚蘭進(jìn)入分離膠后，電壓改為120 V，繼續(xù)電泳80 min。使用甲醇化的硝酸纖維素(PVDF)膜在350 mA電流下轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶封閉。分別加入兔抗大鼠p65、CXCR4蛋白抗體，置于水平搖床4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST對(duì)PVDF膜漂洗3次，每次10 min，加入二抗IgG(羊抗兔紅外二抗)，室溫避光孵育1 h；再用TBST對(duì)PVDF膜漂洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描，并采用Image-Pro Plus6.0軟件分析灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞生存率比較 含藥血清高、中、低濃度組與空白對(duì)照組細(xì)胞生存率分別為(99.80±1.23)%、(102.92±1.49)%、(102.65±1.43)%、(101.71±0.91)%，多組間比較P>0.05。

2.2 各組細(xì)胞遷移數(shù)量比較 含藥血清高、中、低濃度組與空白對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(95.00±1.78)、(69.75±1.89)、(17.25±0.95)、(16.50±0.65)個(gè)，含藥血清高、中濃度組均高于含藥血清低濃度組、空白對(duì)照組，且含藥血清高濃度組高于含藥血清中濃度組(P均<0.05)；空白對(duì)照組與含藥血清低濃度組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組p65、CXCR4蛋白表達(dá)比較 各組p65、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較P<0.05，組間兩兩比較P均<0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組p65、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

2009年Krap等[9]建議將MSC歸巢定義為：MSC在目標(biāo)組織的脈管系統(tǒng)里被捕獲，隨后跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至目標(biāo)組織的過(guò)程。對(duì)于歸巢機(jī)制，尤其是干細(xì)胞的動(dòng)員，目前仍無(wú)法準(zhǔn)確闡述，大部分研究文獻(xiàn)基于白細(xì)胞遷移、人類(lèi)干細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞研究干細(xì)胞的遷移行為，針對(duì)各種細(xì)胞表面受體及細(xì)胞因子進(jìn)行探索。SDF-1又稱(chēng)CXCL12，是趨化因子家族中的CXC亞族。CXCR4是目前研究最多的SDF-1受體，可同時(shí)在多種細(xì)胞表面表達(dá)，包括血液細(xì)胞、造血干細(xì)胞(HSCs)、胚胎干細(xì)胞(ES)[10]。研究表明，趨化因子家族及其受體不但能介導(dǎo)白細(xì)胞遷移，同時(shí)在MSC歸巢中也發(fā)揮著重要作用，其中SDF-1/CXCR4軸的主要功能之一就是調(diào)節(jié)前體細(xì)胞的趨化及歸巢至受傷部位[11]。

當(dāng)組織受到損傷時(shí)，局部SDF-1表達(dá)上調(diào)，營(yíng)造出一個(gè)SDF-1高濃度環(huán)境，隨著距離的增加，SDF-1濃度梯度遞減，而趨化表達(dá)CXCR4的MSC沿著這個(gè)濃度梯度到達(dá)組織損傷部位，參與組織的修復(fù)與重建。亦有學(xué)者認(rèn)為，SDF-1α/CXCR4趨化信號(hào)軸是進(jìn)化上高度保守的介導(dǎo)干細(xì)胞遷移、分布的關(guān)鍵信號(hào)[12]，在MSCs募集和定向遷移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。Pereira等[13]將SDF-1注射入髓核中，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠穿越軟骨終板，向髓核遷移。CXCR4是決定MSCs歸巢能力的主要效應(yīng)分子，其表達(dá)水平將直接影響MSCs的遷移能力。Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)CXCR4的BMSCs向SDF-1的遷移能力增強(qiáng)，其在椎間盤(pán)組織存活時(shí)間更久，對(duì)椎間盤(pán)組織的再生和修復(fù)能力更強(qiáng)。SDF-1/CXCR4信號(hào)軸可激活多重信號(hào)通道，包括MAPK p42/44、Jak/STAT和PI3K-AKT-NF-κB信號(hào)通道[15]。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在許多細(xì)胞刺激介導(dǎo)細(xì)胞信息的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是細(xì)胞激活的標(biāo)志，參與正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[16]。NF-κB可通過(guò)調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4信號(hào)軸參與細(xì)胞的遷移、侵襲等過(guò)程，CXCR4表達(dá)是NF-κB和CXCR4基因啟動(dòng)子通過(guò)調(diào)節(jié)p50/p65結(jié)合位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，部分中藥對(duì)干細(xì)胞歸巢具有一定的調(diào)節(jié)作用[17,18]，尤其是補(bǔ)腎活血類(lèi)中藥，不但能夠調(diào)節(jié)CXCR4表達(dá)[5]，還能促進(jìn)BMSCs的遷移[6]。前期研究顯示，補(bǔ)腎活血舒筋方可以通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，抑制椎間盤(pán)的退變[7]。本研究各組間細(xì)胞生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而含藥血清高、中濃度組細(xì)胞遷移數(shù)量均高于含藥血清低濃度組、空白對(duì)照組，說(shuō)明補(bǔ)腎活血舒筋方對(duì)BMSCs增殖無(wú)明顯影響，但中、高濃度時(shí)可促進(jìn)其遷移?？紤]補(bǔ)腎活血舒筋方影響細(xì)胞遷移時(shí)存在一定的藥物濃度閾值，需要達(dá)到一定的藥物濃度，細(xì)胞才可能被動(dòng)員，發(fā)生遷移。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清可促進(jìn)p65、CXCR4蛋白表達(dá)，并呈濃度依賴性；說(shuō)明補(bǔ)腎活血舒筋方可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)CXCR4蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs遷移。

綜上所述，2.2、4.4 g/mL補(bǔ)腎活血舒筋方含藥血清可促進(jìn)BMSCs遷移，但對(duì)BMSCs增殖無(wú)影響；激活NF-κB信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

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江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20151064)。

謝林(E-mail： xielin117@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.011

R329

A

1002-266X(2017)16-0038-03

2016-10-15)