蘇錦松+趙彩云+文檢+劉川+謝彩香+張藝

[摘要] 為了解決野生藏藥資源日益瀕危問題，推動藏藥野生資源保護與適宜區(qū)的發(fā)展和提供人工栽培種植新方法，該文采用HPLC對不同產(chǎn)地中國沙棘葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素進行含量測定，應(yīng)用偏最小二乘回歸法（PLSR），分析不同產(chǎn)地中國沙棘葉中黃酮類化學(xué)成分與生態(tài)因子間的相關(guān)性。該文基于Maxent模型結(jié)合運用ArcGIS軟件，對中國沙棘進行適宜區(qū)區(qū)劃研究。分析得出不同產(chǎn)地間中國沙棘葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素含量差異明顯，且影響槲皮素積累的主導(dǎo)因子為海拔高度、1月份均降水量和8月份均降水量，影響山柰素含量積累的主導(dǎo)因子為海拔高度、最冷季度降水量、12月份均降水量和3月份均氣溫，影響異鼠李素含量積累的主導(dǎo)因子為8月份均降水量、1月份均降水量、最冷季度降水量和海拔高度；實驗結(jié)果表明中國沙棘在我國地區(qū)分布的適宜指數(shù)為0～0.708，適宜區(qū)面積59.05萬km2，占全國總面積的6.13%，較適宜區(qū)面積達55.25萬km2，占全國總面積的5.73%。對中國沙棘葉黃酮類成分與生態(tài)因子的相關(guān)性及中國沙棘生態(tài)適宜性研究，該法操作簡單可行、結(jié)果可靠，為藏藥資源實現(xiàn)可持續(xù)開發(fā)利用提供了一種新思路。

[關(guān)鍵詞] 藏藥； 中國沙棘葉； 黃酮； 生態(tài)因子； 生態(tài)適宜性； Maxent模型

[Abstract] The study aims at providing a new suitable way to promote artificial cultivation， solving the problem of resources increasingly endangered wild medicine， and protecting the wild resources of Tibetan medicine. The content of quercetin，kaempferol and isorhamnetin was determined by HPLC. The correlation between flavonoids components and ecological factors was analyzed using partial least-squares regression （PLSR）. Based on Maxent model combining using ArcGIS software， suitable regionalization for H.rhamnoides subsp. sinensis was studied.The results showed that the difference of quercetin，kaempferol and isorhamnetin content in samples from different regions were obvious. The main factors effecting quercetin content accumulation were the altitude andthe average monthly precipitation in January and August. The main factors effecting kaempferol accumulation were the altitude andthe average monthly precipitation in the coldest quarter and December. The main factors effecting isorhamnetin accumulation were the average monthly precipitation in August， January and the coldest quarter.The regional distribution suitability index for H.rhamnoides subsp. sinensis was 0-0.708. The suitable area 590 500 km2， accounting for 6.13% of the total area. The preferably suitable area was 552 500 km2， accounting for 5.73% of the total area.The methods used in the study is simple and feasible， the result is reliable which provide a new approach for Tibetan medicine resources sustainable exploitation and utilization.

[Key words] Tibetan medicine； Hippophae rhamnoides subsp. sinensis leaf； flavonoids； ecological factors； ecological suitability； Maxent model

沙棘Hippophae rhamnoides L.，又名醋柳、黑刺、酸刺，系胡頹子科Elaeagnaceae沙棘屬Hippophae Linn.灌木或喬木[1]。中國沙棘H. rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi是我國特有種，在國內(nèi)分布最廣、且用量最大，主要分布在西北、華北和東北各省[2-4] 的河流、山川以及丘陵溝谷兩岸，分布資源量大[5]。目前對于中國沙棘的研究，多集中于化學(xué)成分[6]、藥理活性、臨床應(yīng)用[7]、產(chǎn)品開發(fā)[8]和生態(tài)環(huán)境改造[9-10]等。黃酮類對癌癥、糖尿病和心血管疾病等慢性疾病的預(yù)防和管理都有潛在的治療作用[11-13]。沙棘中含有豐富的黃酮類化合物，主要以槲皮素、異鼠李素、山柰素的苷存在[14-15]。本研究應(yīng)用偏最小二乘回歸法[16-19]（PLSR）分析中國沙棘葉黃酮類成分與氣候因子相關(guān)性，并進一步對影響中國沙棘葉化學(xué)成分主導(dǎo)生態(tài)因子范圍進行確定。同時運用Maxent模型以及GIS技術(shù)[20-21]對中國沙棘進行適宜性區(qū)劃研究，找出影響中國沙棘分布的主要生態(tài)因子以及生態(tài)適宜區(qū)，對其進行分布預(yù)測和適生等級劃分，指導(dǎo)中國沙棘的野生資源保護和在適生區(qū)推廣人工種植。

1 材料

1.1 植物 樣品來源于四川省、西藏自治區(qū)、甘肅省和山西省，共17批次，實地采集新鮮葉片，用硅膠干燥，并記錄采集地海拔及經(jīng)緯度，見表1。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定均為胡頹子科沙棘屬植物中國沙棘H. rhamnoides subsp. sinensis的干燥葉片，憑證標(biāo)本保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院標(biāo)本室。

1.2 中國沙棘地理分布數(shù)據(jù) 中國沙棘在中國的分布數(shù)據(jù)，主要來源于中國數(shù)字植物標(biāo)本館（http：//www.cvh.org.cn/），以及文獻整理與實地采樣調(diào)查。野外采集的中國沙棘標(biāo)本，由成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定。初步收集中國沙棘分布點161個，包括物種名、經(jīng)度和緯度等準(zhǔn)確信息，主要分布于四川、甘肅、山西、青海、陜西等地區(qū)。

1.3 生態(tài)因子數(shù)據(jù) 本文所使用的氣候和高程數(shù)據(jù)來源于全球氣候數(shù)據(jù)庫（Worldclim；http：//www.worldclim.org/），由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所資源中心提供，包含海拔、月平均降水量、月平均氣溫等44個生態(tài)因子。

2 方法

2.1 中國沙棘葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量測定 采用高相液相色譜法（HPLC）測定中國沙棘葉黃酮類成分（槲皮素、山柰素、異鼠李素）。精密稱定樣品粉末（過3號篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入乙醇50 mL，稱重，水浴加熱（80 ℃）回流60 min，冷卻，再稱重，用乙醇補足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，加鹽酸4 mL，水浴加熱（80 ℃）水解30 min，立即冷卻，濾過。取續(xù)濾液過微孔濾膜作為供試品溶液。色譜條件為：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃，流速 1.0 mL·min^-1，進樣量10 μL，檢測波長370 nm，流動相甲醇-0.4%磷酸溶液（54∶46）。方法學(xué)考察結(jié)果顯示精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

2.2 適宜性分布區(qū)域劃研究 本文從44個生態(tài)因子中初步篩選出19個貢獻率較高的生態(tài)因子，再基于Maxent模型ROC評價曲線，同時運用ArcGIS軟件，選取總貢獻率≥90%的11個生態(tài)因子作為主要生態(tài)因子，再加載到ArcMap中。加入從國家基礎(chǔ)地理信息系統(tǒng)網(wǎng)站下載的中國地圖，采用人工（manual）分級方法分析，劃分出中國沙棘適宜性分布區(qū)域，分為適宜區(qū)、較適宜區(qū)和不適宜區(qū)。

2.3 偏最小二乘回歸法分析 應(yīng)用SIMCA-P 11.5 軟件檢驗方法進行PLSR分析，分析不同地區(qū)中國沙棘葉化學(xué)成分及其影響因子的相關(guān)變化趨勢。將有效成分作為因變量，生態(tài)因子值作為自變量建立回歸模型。各自變量縱坐標(biāo)為正，則因變量與該自變量呈正相關(guān)；縱坐標(biāo)為負(fù)，則表現(xiàn)負(fù)相關(guān)。最后通過變量投影重要性指標(biāo) （variable importance in projection，VIP）來測量，其值越大，說明自變量的重要程度越大。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地中國沙棘葉中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量比較分析 本文分為4個產(chǎn)地，分別是四川、西藏、甘肅和山西。不同產(chǎn)地間中國沙棘葉的化學(xué)成分含量存在差異。其中，各產(chǎn)地槲皮素平均含量大小為四川>甘肅>西藏>山西；各產(chǎn)地山柰素平均含量大小為甘肅>西藏>四川>山西；各產(chǎn)地異鼠李素平均含量大小為四川>西藏>甘肅>山西，見圖1。

3.2 中國沙棘適宜性區(qū)劃分析 根據(jù)Maxent模型預(yù)測結(jié)果，用GIS軟件空間分析工具，得到中國沙棘在我國的適宜指數(shù)為0～0.708。再根據(jù)中國沙棘資源調(diào)查以及已知的分布情況，采用人工分級方法分析，分為3個等級：適生性概率（即適合中國沙棘生長的可能性概率）0～0.2為非適宜區(qū)，適生性概率0.2～0.4較適宜區(qū)，適生性概率0.4以上為適宜區(qū)，見圖2。

由圖2可知，中國沙棘在我國分布范圍涉及山西、陜西、甘肅、寧夏、青海、四川、西藏、內(nèi)蒙古、河北、遼寧10?。ㄗ灾螀^(qū)）。適宜區(qū)主要集中于黃土高原以及青藏高原東北至東南的邊緣地區(qū)，從西南向東北方向呈帶狀分布在橫斷山脈東北側(cè)與太行山脈之間。適宜區(qū)包括四川省的阿壩藏族羌族自治州紅原、若爾蓋以及甘孜藏族自治州甘孜、德格、石渠地區(qū)；青海省的西寧、黃南藏族自治州、海北藏族自治州以及海東地區(qū)；甘肅省南部的蘭州、甘南藏族自治州、定西、臨夏、天水、隴南、平?jīng)觥c陽地區(qū)；寧夏回族自治區(qū)的固原以及中衛(wèi)、吳忠的南部地區(qū)；陜西省的榆林、延安，以及寶雞、漢中、咸陽與甘肅交界地區(qū)；

山西省中部的太原、呂梁、晉中、長治、臨汾地區(qū)；西藏自治區(qū)東部的拉薩、林芝、昌都地區(qū)。適宜區(qū)面積59.05萬km2，占全國總面積的6.13%。較適宜區(qū)域主要位于極高適生分布區(qū)域的外緣，向北延伸至河北、遼寧、內(nèi)蒙古地區(qū)。較適宜區(qū)面積55.25萬km2，占全國總面積的5.73%。

3.3 生態(tài)因子與化學(xué)成分含量的PLSR分析 選取總貢獻率≥90%的11個生態(tài)因子，對不同產(chǎn)地的中國沙棘葉與其進行PLSR分析，其中11個生態(tài)因子包括：海拔X1、最冷季度降水量X2、最暖季度降水量X3、1月月均降水量X4、最干季度平均溫度X6、8月月均降水量X7、11月月平均氣溫X8、3月月平均氣溫X9、2月月平均氣溫X10和1月月平均氣溫X11。結(jié)果表明，中國沙棘葉中槲皮素含量（Y）與11個生態(tài)因子間的PLSR模型為：Y=0.765X1+0.297X2+0.073X3+0.504X4+0.003X5-0.006X6-0.432X7-0.002X8+0.007X9+0.026X10-0.063X11；中國沙棘葉中山柰素含量（Y）與11個生態(tài)因子間的PLSR模型為：Y =0.473X1-0.125X2+0.046X3-0.061X4-0.236X5-0.002X6+0.007X7+0.025X8-0.199X9-0.049X10+0.010X11；中國沙棘葉中異鼠李素含量（Y）與11個生態(tài)因子間的PLSR模型為：Y=0.831X1+0.273X2-0.163X3+0.640X4-0.074X5-0.004X6-0.961X7-0.034X8+0.287X9+0.133X10-0.135X11，見圖3。

由圖3（A）可以看出，海拔高度與中國沙棘葉中槲皮素含量呈極顯著正相關(guān)，其次為1月份均降水量和最冷季度降水量；8月份均降水量與槲皮素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。VIP直方圖結(jié)果表明：海拔高度（1.575），1月份均降水量（1.441）和8月份均降水量（1.143）的權(quán)重系數(shù)>1，是影響槲皮素含量的最主要因素；最冷季度降水量（0.998），最暖季度降水量（0.831）的權(quán)重系數(shù)>0.8，是影響槲皮素含量的次主要因素；其余6個生態(tài)因子對槲皮素含量基本不具備解釋意義。

由圖3（B）可以看出，海拔高度與中國沙棘葉中山柰素含量呈極顯著正相關(guān)，其次為最暖季度降水量；12月份均降水量與山柰素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，其次為3月份平均氣溫和最冷季度降水量。VIP直方圖結(jié)果表明：海拔高度（1.713），12月份均降水量（1.437），3月份平均氣溫（1.322）和最冷季度降水量（1.098）的權(quán)重系數(shù)>1，是影響山柰素含量的最主要因素；1月份均降水量（0.922），最暖季度降水量（0.885）和2月份平均氣溫（0.817）的權(quán)重系數(shù)>0.8，是影響山柰素含量的次要主要因素；其余4個生態(tài)因子對山柰素含量基本不具備解釋意義。

由圖3（C）可以看出，海拔高度與中國沙棘葉中異鼠李素含量呈極顯著正相關(guān)，其次為1月份均降水量和最冷季度降水量；8月份均降水量與異鼠李素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。VIP直方圖結(jié)果表明：8月份均降水量（1.858），海拔高度（1.245），1月份均降水量（1.121）和最冷季度降水量（1.077）的權(quán)重系數(shù)>1，是影響異鼠李素含量的最主要因素；3月份平均氣溫（0.957），最暖季度降水量（0.821）的權(quán)重系數(shù)>0.8，是影響異鼠李素含量的次要主要因素；其余5個生態(tài)因子對異鼠李素含量基本不具備解釋意義。

4 討論

4.1 中國沙棘葉黃酮類成分與生態(tài)因子相關(guān)性研究 在含量測定中，發(fā)現(xiàn)了來自四川省阿壩州紅原縣阿木鄉(xiāng)的1批次中國沙棘葉中異鼠李素質(zhì)量數(shù)為0.62%，明顯高于其他16個批次的含量。原因可能為紅原縣海拔高，溫度常年偏低，對異鼠李素的積累有促進作用。來自山西4個批次的中國沙棘葉中槲皮素、山柰素和異鼠李素均比來自四川、西藏和甘肅的含量低，山西海拔不到1 000 m，降水，溫度均和其他3個地區(qū)有明顯差異，其含量差異也因有一定相關(guān)性。

確定了影響中國沙棘葉中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量積累的主導(dǎo)生態(tài)因子具體如下：影響槲皮素積累的主導(dǎo)因子為海拔高度、1月份均降水量和8月份均降水量；影響山柰素含量積累的主導(dǎo)因子為海拔高度、最冷季度降水量、12月份均降水量和3月平均氣溫；影響異鼠李素含量積累的主導(dǎo)因子為8月分均降水量、1月份均降水量、最冷季度降水量和海拔高度。

采用HPLC對17批次不同產(chǎn)地中國沙棘葉黃酮類成分進行了分析，評價比較了其質(zhì)量差異，發(fā)現(xiàn)來四川、西藏、甘肅等不同產(chǎn)區(qū)的中國沙棘葉品質(zhì)存在差異性，同時也有一定的相關(guān)性。同時，結(jié)合PLSR探討了經(jīng)緯度、溫度、降水等生態(tài)因子對其化學(xué)成分的影響，最終明確影響槲皮素、山柰素和異鼠李素含量積累的主導(dǎo)因，為藏藥中國沙棘的栽培、采收以及適宜性推廣提供了科學(xué)依據(jù)。

通過SIMCA-P分析對生態(tài)因子研究時，發(fā)現(xiàn)對于降水量的考察有不足之處，比如四川省阿壩州紅原縣阿木鄉(xiāng)等藏區(qū)，12月份時沙棘葉已經(jīng)大部分凋落，此時研究雨水量對中國沙棘化學(xué)成分積累的影響就與實際情況不相符，所以應(yīng)注重實際情況的考察，注重數(shù)據(jù)來源的科學(xué)性和合理性。

4.2 根據(jù)Maxent生態(tài)位模型分析結(jié)果 中國沙棘在我國地區(qū)分布的適宜指數(shù)為0～0.708，適宜區(qū)主要集中于黃土高原以及青藏高原東北至東南的邊緣地區(qū)，從西南向東北方向呈帶狀分布在橫斷山脈東北側(cè)與太行山脈之間，面積59.05萬km2，占全國總面積的6.13%，涉及山西、陜西、甘肅、寧夏、青海、四川、西藏、內(nèi)蒙古、河北、遼寧10?。ㄗ灾螀^(qū)）；較適宜區(qū)域主要位于極高適生分布區(qū)域的外緣，面積55.25萬km2，占全國總面積的5.73%，涉及河北、遼寧、內(nèi)蒙古等?。ㄗ灾螀^(qū)）。

根據(jù)Maxent生態(tài)位模型的檢驗結(jié)果，并結(jié)合課題組前期資源調(diào)查及文獻中對中國沙棘分布情況的記載，得到Maxent模型的適宜區(qū)區(qū)劃結(jié)果的可信度高，而對于分布區(qū)研究還有GARP，ENFA，Bioclim，Domain等生態(tài)位模型，后期可結(jié)合各種生態(tài)位模型綜合分析，進一步推進中國沙棘資源進行可持續(xù)開發(fā)利用。

從結(jié)果看，適宜區(qū)所涉范圍為采集的地點和標(biāo)本記錄地點，然而研究者之前沒有調(diào)查過的地點，是否有沙棘還未知。Maxent生態(tài)位模型是根據(jù)已有的數(shù)據(jù)進行分析和預(yù)測，對沒有數(shù)據(jù)記錄的省無法分析和預(yù)測，在以后的研究中，會涉及多個省市，確保我們的數(shù)據(jù)包含所有中國沙棘生長區(qū)域，確保數(shù)據(jù)的全面性和科學(xué)性。

[參考文獻]

[1] Rousi A. The genus Hippophae L. A taxonomic study[J]. Ann Bot，1971， 8（3）： 177.

[2] 中國科學(xué)院西北高原生物研究所. 藏藥志[M]. 西寧： 青海人民出版社 1991 ： 104.

[3] 李書心. 遼寧植物志[M]. 沈陽： 遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1988： 1162.

[4] Rongsen L. Seabuckthorn： a multipurpose plant species for fragile mountains[M]. Kathmandu： International Centre for Integrated Mountain Development，1992.

[5] 劉川， 文檢， 蘇永文， 等. HPLC法測定藏藥“巴爾達爾”黃酮類成分含量及指紋圖譜的研究[J]. 中國中藥雜志， 2016， 41（4）： 586.

[6] Kumar M S Y， Tirpude R J， Maheshwari D T， et al. Antioxidant and antimicrobial properties of phenolic rich fraction of Seabuckthorn （Hippophae rhamnoides L.） leaves in vitro[J]. Food Chem， 2013， 141（4）： 3443.

[7] Lee H， Kim M， Lee K， Mi， et al. Anti-visceral obesity and antioxidant effects of powdered sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） leaf tea in diet-induced obese mice[J]. Food Chem Toxicol，2011， 49（9）： 2370.

[8] 劉雪凌， 權(quán)永榮， 陳旭華. 沙棘產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用前景[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012， 40（16）： 8960.

[9] 陳玉芳. 沙棘林學(xué)特性及造林技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015 （5）： 183.

[10] 張瑞， 白鳳林， 賈利紅， 等.晉陜蒙砒砂巖區(qū)十大孔兌沙棘種植抗旱措施[J]. 中國水土保持，2015， 1（4）： 3.

[11] Andrae-Marobela K， Ghislain F W， Okatch H， et al. Polyphenols： a diverse class of multi-target anti-HIV-1 agents[J]. Curr Drug Metab，2013， 14（4）： 392.

[12] Johnson M H， de Mejia E G， Fan J， et al. Anthocyanins and proanthocyanidins from blueberry-blackberry fermented beverages inhibit markers of inflammation in macrophages and carbohydrate-utilizing enzymes in vitro[J]. Mol Nutr Food Res，2013， 57（7）： 1182.

[13] Jacques P F， Cassidy A， Rogers G， et al. Higher dietary flavonol intake is associated with lower incidence of type 2 diabetes[J]. J Nutr，2013， 143（9）： 1474.

[14] Teleszko M， Wojdyo A， Rudzińska M， et al. Analysis of lipophilic and hydrophilic bioactive compounds content in sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries[J]. J Agric Food Chem，2015， 63（16）： 4120.

[15] Ma X， Laaksonen O， Zheng J， et al. Flavonol glycosides in berries of two major subspecies of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） and influence of growth sites[J]. Food Chem，2016， 200： 189.

[16] 王惠文. 偏最小二乘回歸方法及其應(yīng)用[M]. 北京： 國防工業(yè)出版社， 1999.

[17] 賈光林， 黃林芳， 索風(fēng)梅， 等.人參藥材中人參皂苷與生態(tài)因子的相關(guān)性及人參生態(tài)區(qū)劃[J]. 植物生態(tài)學(xué)報，2012， 36（4）： 302.

[18] 李文濤， 黃林芳， 杜靜， 等.基于 PLS 分析石斛品質(zhì)與生態(tài)因子的相關(guān)性[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2013， 24（10）： 2787.

[19] 侯美亭， 胡偉， 喬海龍， 等.偏最小二乘 （PLS） 回歸方法在中國東部植被變化歸因研究中的應(yīng)用[J]. 自然資源學(xué)報，2015， 30（3）： 409.

[20] 胡忠俊， 張鐿鋰， 于海彬. 基于 MaxEnt 模型和 GIS 的青藏高原紫花針茅分布格局模擬[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2015， 26（2）： 505.

[21] Cao B， Bai C K， Zhang L L， et al. Modeling habitat distribution of Cornus officinalis with Maxent modeling and fuzzy logics in China[J]. J Plant Ecol，2016， doi： 10.1093/jpe/rtw1009.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]