姚 青，周 月，蘆曉紅，燕曉雯，馬曉東

·論 著·

三七總皂苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變內(nèi)皮素-1表達的影響

姚 青1，周 月1，蘆曉紅1，燕曉雯1，馬曉東2

目的 探討三七總皂苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和內(nèi)皮素-1(ET-1)的影響。方法 采用鏈脲佐菌素(65 mg/kg)腹腔注射的方法建立大鼠模型，選取50只SD大鼠，將其隨機分為5組：正常對照組，糖尿病模型組，三七總皂苷高劑量組(150 mg/kg)，三七總皂苷低劑量組(50 mg/kg)以及導(dǎo)升明組(167 mg/kg)。灌胃給藥20周后處死大鼠，取大鼠血清檢測AngⅡ和ET-1的含量，摘取眼球，剝離大鼠眼球的視網(wǎng)膜組織，采用免疫組織化學(xué)法及熒光定量PCR法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1蛋白及mRNA的表達水平。結(jié)果 與正常對照組相比，糖尿病大鼠血清中AngⅡ和ET-1的含量明顯增加(P<0.05)，三七總皂苷組中的大鼠血清AngⅡ和ET-1的含量[(336.9±85.9)ng/L，(59.8±8.4)ng/L)]明顯低于糖尿病模型組[(557.9±86.2)ng/L，(89.8±7.2)ng/L,P<0.05)]。同時，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1蛋白及mRNA的表達增加，而三七總皂苷組和導(dǎo)升明組大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1的表達明顯低于糖尿病模型組大鼠(P<0.05)。結(jié)論 三七總皂苷可能通過降低大鼠血清中AngⅡ和ET-1以及糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1蛋白與mRNA的表達水平，從而延緩糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展。

三七總皂苷；糖尿病視網(wǎng)膜病變；內(nèi)皮素-1；血管緊張素Ⅱ

糖尿病患者內(nèi)分泌代謝紊亂，增高的血糖會導(dǎo)致患者全身微循環(huán)系統(tǒng)處于缺氧狀態(tài)，而長期的缺血缺氧狀態(tài)將會造成血管內(nèi)皮尤其是微血管內(nèi)皮細胞的損傷。正常的內(nèi)皮細胞通過感受機械及化學(xué)刺激來維持血管收縮與舒張之間的動態(tài)平衡，而糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞損傷，致使某些血管活性物質(zhì)表達異常，導(dǎo)致血管收縮及舒張功能失調(diào)，最終可能造成視網(wǎng)膜微血管血流量的降低，同時血管的血流速度下降，從而造成眼部組織灌流減少，加重糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展[1-3]。內(nèi)皮源性收縮因子(EDCFs)中的內(nèi)皮素(Endothelin vessels-1，ET-1)是血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，具有強烈縮血管效應(yīng)的多肽[4]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是由AngⅠ經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水解產(chǎn)生，能夠促進ET-1基因表達、合成和分泌的強效刺激因子[5]。AngⅡ和ET-1均是能夠影響視網(wǎng)膜血流的血管活性物質(zhì)。三七總皂苷是三七的主要活性成分，研究表明其能降低機體的耗氧量，提高機體對缺氧的耐受力，有效改善微循環(huán)，增加血流量，擴張痙攣血管，還有抗血栓和抗凝血作用。目前，臨床主要用于腦血管后遺癥、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞等疾病的治療[6]。前期研究已經(jīng)證實，三七總皂苷可以明顯改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的功能[7]。本研究旨在探討三七總皂苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變早期干預(yù)，觀察三七總皂苷對糖尿病大鼠血清AngⅡ、ET-1和視網(wǎng)膜組織中ET-1蛋白和mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選擇健康雄性Sprague Dawley大鼠(SPF級)50只，體重(250±20)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號NXSY(寧)2011-0001]。所有大鼠均飼以常規(guī)動物飼料和水，在寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室飼養(yǎng)。

1.2 藥物和試劑：三七總皂苷(血栓通膠囊，黑龍江省珍寶島制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(Sigma公司，美國)；導(dǎo)升明(西安利君制藥公司)；ET-1和AngⅡ測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ET-1抗體(Proteintech公司)；PCR引物(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)；qRT-PCR試劑盒(Thermo公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq 酶(Fermentens公司)；Tizol試劑(Invitrogen公司)。

1.3 儀器：熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)；Image Lab凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD，美國)；FreeStyle型培利舒坦血糖儀(雅培公司，美國)；酶標(biāo)儀(BIORAD，美國)。

1.4 糖尿病大鼠模型的建立：將SD大鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(按照65 mg/kg體重的劑量)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。正常對照組注射同等量的溶劑。1周后，將大鼠禁食6 h，從尾靜脈采血以檢測血糖，將血糖≥16.7 mmol/L者作為糖尿病大鼠模型。

1.5 方法：選取糖尿病模型SD大鼠40只，隨機分為4組，分別為糖尿病模型組、三七總皂苷高劑量組(150 mg/kg)、三七總皂苷低劑量組(50 mg/kg)和導(dǎo)升明組(167 mg/kg)，另外選取大鼠10只設(shè)為正常對照組。采用灌胃給藥，每天1次，共20周，每4周檢測血糖1次。飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 大鼠血清AngⅡ和ET-1的檢測：腹腔注射2%戊巴比妥鈉使大鼠麻醉后，腹主動脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中ET-1、AngⅡ含量(按試劑盒說明書進行操作)。

1.6.2 視網(wǎng)膜切片標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色：將處死后的大鼠右眼用4%多聚甲醛溶液固定，采用LSAB法，脫水石蠟包埋，切片脫蠟，梯度酒精水化，3% H2O2氧化15 min，流水漂洗5 min，滴加兔抗大鼠ET-1多抗1∶100。濕盒孵育24 h后，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析。

1.6.3 熒光定量PCR反應(yīng)：Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:總RNA 3 μg,OligodT 1 μl,dNTP 1 μl,5×Buffer 4 μl,逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl,加無菌水至體系20 μl。引物序列：β-actin 上游5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3’，下游5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3’；ET-1上游5’TTCCCGTGATCTTCTCTCTGCT3’，下游5’TCTGCTTGGCAGAAATTCCA3’。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。得到Ct值，通過β-actin校正，得到每份樣品中ET-1的相對表達量，即Quantity(ET-1/β-actin)。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠給藥前后的血糖水平：糖尿病大鼠各劑量組的血糖較正常對照組明顯升高(P<0.05)，但各劑量組的血糖水平在給藥前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時，三七總皂苷組和導(dǎo)升明組大鼠血糖水平與糖尿病大鼠模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血糖的比較

2.2 5組大鼠血清AngⅡ和ET-1含量的比較:糖尿病模型組大鼠血清AngⅡ和ET-1水平顯著升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.376,P<0.05)。三七總皂苷各劑量組和導(dǎo)升明組糖尿病大鼠血清Ang Ⅱ與ET-1水平較糖尿病模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.925,P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清Ang Ⅱ和ET-1的比較

注：#與正常對照組比較，P<0.05；*與模型組比較，P<0.05。

2.3 5組大鼠視網(wǎng)膜組織ET-1蛋白及mRNA表達的比較：糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1的表達，明顯高于正常大鼠組(t=5.978,P<0.05)；三七總皂苷組及導(dǎo)升明組大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1的表達明顯低于模型組(t=7.453,P<0.05)；糖尿病大鼠模型組視網(wǎng)膜組織中ET-1mRNA的表達也明顯高于正常組(t=4.675,P<0.05)；三七總皂苷組及導(dǎo)升明組大鼠視網(wǎng)膜組織中ET-1mRNA值與模型組相比均有下降(t=3.908,P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜ET-1表達累積吸光度(IOD)及ET-1mRNA值

注：#與正常對照組比較，P<0.05；*與模型組比較，P<0.05。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，它能夠引起成年人低視力、視物模糊，甚至視力喪失，從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究資料表明，具有10年病史的糖尿病患者中視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率為50%，超過20年病史的糖尿病患者，視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率接近100%。高血糖已經(jīng)被證實是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的主要致病因素。研究表明，增高的血糖通過損害血管內(nèi)皮細胞和線粒體，造成視網(wǎng)膜缺血缺氧，進而導(dǎo)致患者出現(xiàn)微動脈瘤、視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜水腫及新生血管形成，甚至視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重后果。

AngⅡ是由AngⅠ經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水解產(chǎn)生的，能夠與血管平滑肌上的AngⅡ受體結(jié)合，促進全身微動脈收縮[8-10]。研究表明，在糖尿病高血糖的刺激下，患者AngⅠ和AngⅡ均明顯升高。AngⅡ是ET-1表達、合成和分泌的強效刺激因子。而ET-1是內(nèi)皮細胞和心臟產(chǎn)生，具有強烈縮血管和促進細胞生長增殖作用的血管活性多肽，它是由21個氨基酸殘基組成，分子量為2 492 kD。人體有3種結(jié)構(gòu)功能相似的ET，分別稱為ET-1、ET-2與ET-3，其中以ET-1是目前已知作用最強、持續(xù)時間最長的縮血管肽[11-13]。糖尿病患者血糖過高會導(dǎo)致血流速度減慢，造成組織缺血缺氧，從而導(dǎo)致患者全身血管內(nèi)皮細胞損傷，血小板易聚集黏附在損傷的血管內(nèi)皮上，刺激損傷的內(nèi)皮血管細胞中ET-1的代償性分泌[14]。研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜疾病患者血清ET-1水平明顯升高，而經(jīng)控制血糖水平后ET-1的水平又呈下降趨勢，提示正常生理情況下視網(wǎng)膜循環(huán)主要通過旁分泌和(或)胞內(nèi)分泌來調(diào)節(jié)血管張力和器官血流量，當(dāng)糖尿病患者血糖升高時會刺激ET-1的釋放，高濃度ET-1通過強烈收縮血管、促進細胞增殖，促使視網(wǎng)膜微循環(huán)發(fā)生障礙[15-16]。因此，測定血清ET-1含量可準(zhǔn)確反映體內(nèi)血管內(nèi)皮細胞損傷程度。

三七總皂苷是三七的主要有效成分之一，具有活血化瘀、通脈活絡(luò)、抑制血小板聚集和增加心腦血流量的功效?，F(xiàn)代研究證明三七總皂苷能夠顯著降低高血壓患者的MDA，明顯升高SOD，增加紅細胞變形能力，降低紅細胞的聚集性。動物實驗顯示，三七總皂苷可使大鼠實驗性室性早搏明顯減少，心率失常持續(xù)時間明顯縮短，明顯降低大鼠心梗后再灌注時心律失常的發(fā)生率。另外，三七總皂苷還能夠顯著抑制血小板聚集和黏附，改善微循環(huán)，具有抗血栓和抗凝血作用。課題組前期研究已經(jīng)證實三七總皂苷可以明顯改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜電生理，增加視網(wǎng)膜毛細血管的血流速度，顯示了良好的藥效。

本研究利用STZ構(gòu)建糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型，灌胃給予不同劑量的三七總皂苷，觀察大鼠視網(wǎng)膜組織AngⅡ和ET-1的表達情況。結(jié)果顯示，糖尿病大鼠血糖較正常對照組明顯升高，三七總皂苷各劑量組的血糖水平較給藥前下降。但是三七總皂苷組和導(dǎo)升明組大鼠血糖水平與糖尿病大鼠模型組無顯著性差異，說明三七總皂苷對血糖水平的影響不明顯。同時，與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠血清AngⅡ和ET-1水平均顯著升高，說明糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能受到損傷，而血管內(nèi)皮受損是導(dǎo)致糖尿病微血管病變的主要機制。給予不同劑量的三七總皂苷干預(yù)治療后,三七總皂苷組糖尿病大鼠血清AngⅡ和ET-1的含量較模型組均有不同程度的降低，尤其是三七總皂苷高劑量組改善最為明顯；而導(dǎo)升明組也可以降低大鼠血清AngⅡ和ET-1的含量，但是與三七總皂苷組無明顯差異。同時，免疫組織化學(xué)和熒光定量PCR的檢測都證實糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織ET-1蛋白及mRNA的表達與正常對照組相比顯著升高。在三七總皂苷的干預(yù)下，大鼠視網(wǎng)膜組織ET-1蛋白及mRNA的表達較模型組大鼠顯著下降，說明三七總皂苷具有改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)血管收縮功能的作用。因此，對AngⅡ和ET-1含量的有效調(diào)節(jié)可能是三七總皂苷改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥效機制之一。

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Effect of panax notoginseng saponins on endothelin-1 in retina of diabetic rats

YAOQing1，ZHOUYue1，LUXiaohong1，YANXiaowen1，MAXiaodong2.
1.NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China;2.NingxiaPeople'sHospital，Yinchuan750002，ChinaCorrespondingauthor:MAXiaodong，Email:mxd119@163.com

Objective To explore the effect of panax notoginseng saponins on the expression of Endothelin-1 and AngⅡin retina of diabetic rats.Methods Streptozotocin (STZ，65 mg/kg) was injected intraperitoneal to establish the diabetic model and the diabetic rats were randomly divided into 5 groups:normal group，diabetic model group，panax notoginseng saponins groups (50 mg/kg，150 mg/kg) and doxium group (167 mg/kg).The normal group and the model group were given water and the other rats were medicated with intragastric administration for 20 weeks，then killed all rats.The serum of AngⅡ and ET-1 levels were measured.The protein expression of ET-1 in retina was detected by using immunological histochemistry assay.The expression of ET-1mRNA in retina of rat was detected by real-time quantitative PCR.Results The level of AngⅡ and ET-1 in serum of model group were(557.9±86.2)ng/L and(89.8±7.2)ng/L，which were higher than those in control group.The protein expression of ET-1 and the expression of ET-1mRNA in model group were higher than those in control group (P<0.05).The level of ET-1 in serum of panax notoginseng saponins groups were lower than those in model group (P<0.05).Compared with the model group，the expression of ET-1 in panax notoginseng saponins groups decreased and the expression of ET-1mRNA were decreased than those in model group (P<0.05).Conclusion Panax notoginseng saponins can decrease the expression of ET-1 in retina of diabetic rats and improve the diabetic retinopathy.

Panaxnotoginsengsaponins；Diabeticretinopathy；Endothelin-1；AngiotensinⅡ

寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ13279)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004 2.寧夏人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750002

姚青(1975-)，女，副教授，博士，主要從事糖尿病眼病的分子機制及藥物治療研究方向。

馬曉東，Email:mxd119@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170508.1147.002.html

10.13621/j.1001-5949.2017.05.0388

R285

A

2016-10-13 [責(zé)任編輯]李 潔