任亮， 付偉， 金素鈺， 黃林， 李彩霞， 鄭玉才*

(1. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041； 2. 四川省廣元市劍閣縣動物疫病預防控制中心，四川廣元628300)

牦牛和雄性不育犏牛睪丸PPP2CA、PME-1基因mRNA水平的比較

任亮1， 2， 付偉1， 金素鈺1， 黃林1， 李彩霞1， 鄭玉才1*

(1. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041； 2. 四川省廣元市劍閣縣動物疫病預防控制中心，四川廣元628300)

蛋白磷酸酶2A(PP2A)參與細胞中蛋白質的可逆磷酸化作用，在磷酸化信號通路調控方面具有重要功能，其活性受蛋白磷酸甲酯酶-1(PME-1)和其他因素的調控。為闡明牦牛雜交雄性不育的分子機制，本研究從牦牛睪丸中克隆了PP2A催化亞基α基因(PPP2CA)和PME-1基因cDNA序列，編碼區(qū)長度分別為930 bp和1 143 bp，編碼的氨基酸序列保守；定量PCR檢測顯示，犏牛(n=7)睪丸中PPP2CA與PME-1基因的mRNA水平均極顯著低于牦牛(n=13，P<0.01)。根據(jù)本研究結果，推測犏牛睪丸中這2個基因的顯著下調可能會影響一些重要信號通路，且與犏牛雄性不育有關。

牦牛； 犏牛； 雜交雄性不育； 蛋白磷酸酶2A； 蛋白磷酸甲酯酶-1

蛋白磷酸酶2A(PP2A)是細胞中主要的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由核心二聚體即催化亞基和結構亞基，以及可變的調節(jié)亞基組成，其中催化亞基包括α和β兩種變異體(Kiely & Kiely，2015)。PP2A在依賴于磷酸化的信號轉導通路中占中心地位，因此，與細胞的很多重要生物學過程相關，例如腫瘤抑制、阿茲海默氏癥等，是潛在的治療靶點(Rudrabhatla & Pant，2011；Perrotti & Neviani，2013；Kiely & Kiely，2015)，并在細胞周期調控方面發(fā)揮重要作用(Yasutis & Kozminski，2013；Wlodarchak & Xing，2016)。

PP2A的活性受多種因素調控(Wlodarchak & Xing，2016)，其中蛋白磷酸甲酯酶-1(PME-1)是PP2A的蛋白質抑制劑，能通過催化PP2A催化亞基羧基端的去甲基化而抑制PP2A活性(Ogrisetal.，1999)。但也有報道PME-1能減少PP2A的降解(Yabeetal.，2015)。PME-1與細胞的生長、分化調控有關，有報道顯示其可通過影響有絲分裂中紡錘體大小而影響細胞的正常分裂(Xiaetal.，2015)。

犏牛是牦牛Bosgrunniens與普通牛B.taurus的種間雜交后代，在產乳和產肉性能等方面比牦牛有明顯優(yōu)勢，但在雜交三代內表現(xiàn)為雄性不育(金帥等，2013)，而雌性雜交后代生殖機能正常。目前，犏牛雄性不育的分子機理尚未被闡明。本課題組在研究睪丸蛋白質組學時發(fā)現(xiàn)，牦牛睪丸中PME-1水平約為犏牛睪丸的8倍(Fuetal.，2015)，推測犏牛不育或與PP2A的表達有關。近年來，蛋白磷酸酶在細胞周期調控中的作用受到重視，由于PP2A催化亞基α基因(PPP2CA)在細胞中的表達遠高于β亞基(Khew-Goodalletal.，1991)，本研究克隆了牦牛PPP2CA和PME-1基因的cDNA序列，并利用熒光定量PCR檢測二者在牦牛和犏牛睪丸中的mRNA水平，為進一步在分子水平上闡明犏牛雄性不育的機制提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

于2014年秋季在成都市青白江區(qū)一屠宰場采集健康的麥洼牦牛和犏牛(普通牛與母麥洼牦牛的雜交F1代)的睪丸組織，包括成年牦牛13頭和犏牛7頭，在屠宰后立刻將其睪丸置于干冰中帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

cDNA反轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；Trizol Reagent(美國Ambion公司)；QuantiFast SYBR Green PCR Kit(德國Qiagen公司)；Cycle-pure Kit(美國OMEGA公司)；pMD 19-T Vector(日本TaKaRa公司)；Super Taq DNA Polymerase(美國GeneCopoeia公司)；DL2000 Marker、DH5α感受態(tài)細胞(北京天根生化科技有限公司)。

Z323K高速冷凍離心機(德國Hermle公司)；OMNI-GLH電動勻漿器(美國OMNI公司)；C1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、C1000 Touch Thermal Cycler熒光定量PCR儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司產品)。

1.3 睪丸組織總RNA的提取及反轉錄

采用Trizol法提取牦牛和犏牛睪丸組織的總RNA，提取步驟參見RNA提取試劑的說明書。紫外分光光度法測定核酸濃度和質量后，利用反轉錄試劑盒以2 μg總RNA為模板，隨機引物進行反轉錄，得到cDNA第一鏈。

1.4 引物設計與PCR擴增

參照GenBank中普通牛PPP2CA(登錄號：BC147979.1)和PME-1(登錄號：BT021563.1)序列，用Primer Premier 5.0分別設計PCR引物(表1)，送上海生工生物工程有限公司合成。

以牦牛睪丸反轉錄cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為：Buffer 2.5 μL，DNA聚合酶0.2 μL，dNTP 0.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，加超純水至25 μL。PCR程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 基因的克隆測序及序列分析

上述PCR產物經(jīng)純化后用pMD 19-T Vector與DH5α感受態(tài)細胞進行連接轉化，將轉化后的感受態(tài)細胞均勻涂在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑單菌落若干，用菌液PCR(反應體系和程序同1.4)鑒定陽性克隆。每個基因選取5個陽性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進行雙向測序，最后用DNAMAN 5.0分析測序結果。

1.6 睪丸組織PPP2CA和PME-1基因的定量分析

以本研究從牦牛睪丸中克隆獲得的PPP2CA和PME-1基因序列，以及以普通牛GAPDH(登錄號：NM001034034)、18s RNA(登錄號：NR036642)序列為模板，用Primer Premier 5.0設計2個目的基因和2個內參基因的定量PCR引物(表1)。

表1 引物序列

以反轉錄獲得的睪丸cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR方法檢測PPP2CA和PME-1基因在牦牛與犏牛睪丸中的相對表達量。PCR反應體系為25 μL，包括2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，RNase-free water 9.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL；反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s(PPP2CA)，65 ℃退火20 s(PME-1)，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)，65～95 ℃制作熔解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。以GAPDH和18s RNA為內參基因，用2-△△Ct法計算PPP2CA和PME-1基因在睪丸中的相對表達水平(Livak & Schmittgen，2001)。在SPSS 18.0中用t檢驗比較牦牛和犏牛睪丸中PPP2CA和PME-1基因mRNA水平表達的差異。

2 結果

2.1 牦牛PPP2CA和PME-1基因的克隆測序

本研究從牦牛睪丸中擴增得到與預期片段長度相符、特異性高的產物(圖1)。PCR產物經(jīng)連接、轉化、菌液PCR檢測等步驟，獲得了相應基因的陽性克隆菌液，進一步測序證實，獲得的牦牛PPP2CA和PME-1基因的長度分別為1 109 bp和1 263 bp。

圖1 牦牛PPP2CA和PME-1基因的PCR擴增結果

M. DL2000 Marker； 1、2泳道分別為PPP2CA、PME-1基因qPCR產物。

M. DL2000 Marker； Lanes 1 and 2 were qPCR products ofPPP2CAandPME-1， respectively.

分析表明，牦牛PPP2CA基因編碼區(qū)長度為930 bp(登錄號：KP223677)，與普通牛序列(登錄號：BC147979)長度相同，但存在2個堿基差異(第252位堿基牦牛為T，普通牛為C；第570位堿基牦牛為C，普通牛為T)，相似性為99.78%。牦牛PPP2CA基因推導的氨基酸序列有309個氨基酸殘基，與普通牛PPP2CA氨基酸序列一致，理論分子量為35.593 kD，預測的等電點為5.307。

實驗獲得的牦牛PME-1基因(登錄號：KP223676)編碼區(qū)與普通牛序列(登錄號：BT021563)長度均為1 143 bp，但存在3個堿基差異(普通牛-牦牛：T243C、A457G、A744G)，相似性為99.74%。由牦牛PME-1基因推導的氨基酸序列有380個氨基酸殘基，與由普通牛PME-1基因推導的相差1個氨基酸(第153位：牦牛為纈氨酸，普通牛為異亮氨酸)。理論分子量為41.695 kD，預測的等電點與普通牛相同，均為5.804。

2.2 牦牛和犏牛睪丸中PPP2CA和PME-1基因mRNA水平的比較

本研究對牦牛和犏牛睪丸中PPP2CA和PME-1基因mRNA水平進行了定量PCR檢測，獲得的擴增效率(E>95%)、標準曲線(R2>0.998)和熔解曲線(圖2)均達到準確定量的標準。結果如圖3所示，犏牛睪丸中PPP2CA與PME-1基因的mRNA水平均極顯著低于牦牛(P<0.01)，其中PME-1基因mRNA水平差異在3倍以上。

3 討論

有關犏牛雄性不育的分子機制近年來有不少報道，但仍無定論。牦牛和犏牛睪丸組織在細胞組成方面有顯著差異(Louetal.，2014)，很多基因在犏牛睪丸中表達顯著下調(屈旭光等，2008；金帥等，2013；Louetal.，2014；雷杰雯等，2016)。這些基因中既有與細胞減數(shù)分裂直接相關的，也有參與信號轉導的，但基因表達與犏牛雄性不育的因果關系尚不清楚。

本研究從牦牛睪丸中克隆了PPP2CA和PME-1基因的cDNA序列。通過與普通牛相應基因的序列比對發(fā)現(xiàn)，這2個基因在進化上保守，這與過去的報道一致(Ogrisetal.，1999)。由牦牛PME-1基因推導的氨基酸序列與普通牛相比僅有1個性質相近的氨基酸差異(纈氨酸替代異亮氨酸)，推測PME-1基因的功能不會有明顯變化。

圖2 PPP2CA基因(A)和PME-1基因(B)的熔解曲線

圖3 牦牛和犏牛睪丸中PPP2CA基因(A)和PME-1基因(B)的mRNA水平

**P<0.01.

定量PCR檢測證實犏牛睪丸中PME-1基因的mRNA水平顯著低于牦牛，這與蛋白水平的分析結果一致(Fuetal.，2015)。PME-1基因能通過催化PPP2CA羧基端的去甲基化而抑制PP2A活性(Ogrisetal.，1999)，但本研究中犏牛睪丸組織中PPP2CA基因mRNA水平仍顯著低于牦牛，并未隨PME-1基因mRNA水平下降而提高，提示PPP2CA基因表達的調控機制可能十分復雜。分析其原因，一方面有報道PME-1基因能減少PP2A的降解(Yabeetal.，2015)；另有研究表明，破壞PME-1基因表達的小鼠組織中，PP2A的催化活性大幅度下降(Ortega-Gutiérrezetal.，2008)。這些結果可能提示適當?shù)腜ME-1基因表達對PP2A功能的必要性。PPP2CA基因在犏牛睪丸中表達水平的下降以及PME-1基因的異常低表達，可能會顯著影響PP2A活性。犏牛睪丸中PME-1基因mRNA和蛋白質水平的顯著降低，很有可能影響睪丸正常的精子發(fā)生過程。由于PP2A在依賴于磷酸化的信號轉導通路中占有非常重要的地位(Wlodarchak & Xing，2016)，其活性改變會引起廣泛的信號通路變化。過去的研究也表明，犏牛睪丸MAPK信號轉導通路中的ERK1、ERK2基因的mRNA水平均顯著下降(雷杰雯等，2016)。有報道稱PP2A會影響多個信號通路，如Wnt通路、mTOR通路、MAPK通路等(Wlodarchak & Xing，2016)，并與細胞的有絲分裂有關(Hunt，2013)。結合本研究和過去對一些信號通路的研究結果(雷杰雯等，2016)，認為犏牛睪丸中可能存在廣泛的信號轉導通路異常。另外，抑制PP2A可能會導致細胞凋亡的增加(Kiely & Kiely，2015)，盡管對此有不同的研究結果，確實有研究觀察到犏牛睪丸細胞凋亡的增加(Louetal.，2014)，這與本研究中犏牛睪丸中PPP2CA基因mRNA水平顯著下降吻合。

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Comparison of mRNA Levels ofPPP2CAandPME-1 Genes in the Testes of Yaks and Sterile Cattle-yaks

REN Liang1， 2， FU Wei1， JIN Suyu1， HUANG Lin1， LI Caixia1， ZHENG Yucai1*

(1. College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China；2. Jiange Animal Disease Control and Prevention Centre， Guangyuan， Sichuan Province 628300， China)

Protein phosphatase 2A (PP2A) mainly functions in protein reversible phosphorylation， and plays a central role in phosphorylation-dependent signaling pathways. Its activity is regulated by protein methylesterase 1 (PME-1) and other factors. To elucidate the molecular mechanism of hybrid male sterility of yaks， we cloned cDNA sequences of catalytic subunit α (PPP2CA) ofPP2AandPME-1 genes. The coding regions of yakPPP2CAandPME-1 genes were 930 bp and 1 143 bp， respectively. The deduced amino acid sequences were conserved. Quantitative PCR assay showed that cattle-yaks (n=7) contained dramatically reduced mRNA levels ofPPP2CAandPME-1 genes in testes than yaks (n=13，P<0.01). The present results suggested that the reduced mRNA levels of the two genes in the testes might influence some important signaling pathways and associate with hybrid male sterility of cattle-yaks.

yak； cattle-yak； hybrid male sterility； protein phosphatase 2A； protein methylesterase 1

2016-11-30 接受日期：2017-02-23

國家自然科學基金項目(31240053)

任亮(1988—)， 助理獸醫(yī)師， 碩士， 研究方向：生化分析及分子生物學方向

*通信作者Corresponding author， 教授， 博士， E-mail:yucaizheng65@hotmail.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160337

Q311

A

1000-7083(2017)03-0306-05