郭慧, 朱曉聞, 歐榮華, 盧芷程, 譚翠婷, 申玉春, 朱春華

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點實驗室，廣東湛江524025)

Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血細胞毒性及caspase-3、α-2M基因表達的影響

郭慧, 朱曉聞, 歐榮華, 盧芷程, 譚翠婷, 申玉春, 朱春華*

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點實驗室，廣東湛江524025)

本研究以Cu2+(0、100 μg·L-1)對羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii進行處理，分別在脅迫后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h收集血淋巴，檢測血細胞中的細胞凋亡率、活性氧(ROS)含量、酯酶活性、一氧化氮(NO)含量以及細胞凋亡執(zhí)行分子caspase-3和免疫因子α-2M基因的表達。結(jié)果顯示，血細胞凋亡率和ROS含量的變化趨勢一致，在脅迫后的6～48 h顯著升高(P<0.05)。酯酶活性在脅迫后的3～48 h均顯著下降(P<0.05)，最低值出現(xiàn)在48 h。在脅迫后的6～48 h，NO含量持續(xù)增加，并與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。caspase-3的相對基因表達量在脅迫后的6～48 h均顯著升高(P<0.05)，并在24 h達到最高值。在脅迫后的12 h，α-2M基因的表達量顯著升高(P<0.05)并達到峰值，在24 h有短暫降低，但與對照組相比仍顯著增加(P<0.05)，在48 hα-2M基因的表達量顯著降低(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，血細胞凋亡率和NO以及ROS都呈顯著的正相關(guān)(P<0.001)。實驗表明，Cu2+脅迫顯著抑制了機體的酯酶活性，誘導(dǎo)NO和ROS的產(chǎn)生以及免疫相關(guān)基因α-2M的表達來對抗Cu2+脅迫帶來的損傷。隨著脅迫時間的延長，過高濃度的NO和ROS對機體自身造成了傷害，并誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達，最終導(dǎo)致細胞凋亡，說明Cu2+對蝦類具有免疫抑制性和毒性。NO和ROS的升高可能是細胞凋亡的主要誘因。

羅氏沼蝦； Cu2+； 血細胞毒性； 基因表達； 細胞凋亡

近年來，隨著我國工廠化和集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，水環(huán)境污染狀況日趨嚴重。在各類環(huán)境污染物中，重金屬由于其遺傳毒性、持久性和不可降解性而備受關(guān)注(Wangetal.，2013)。Cu2+是甲殼動物體內(nèi)必需的微量營養(yǎng)素，參與了多種生理過程，如血藍蛋白的合成、酶功能和組織完整性等(Bharadwajetal.，2014)。但是高濃度的Cu2+亦會對甲殼動物產(chǎn)生毒害作用(Santosetal.，2000；Valavanidis & Vlachogianni，2012)。在生產(chǎn)實踐中，Cu2+作為礦物營養(yǎng)素、除藻劑或病原抑制藥物被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，其中的Cu2+沉淀積累在池塘中，對生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了極大的威脅(Liaoetal.，2006)。據(jù)報道，在我國珠江口地區(qū)Cu2+的濃度處于污染水平，并具有一定的潛在生物毒性(Wangetal.，2015)。研究表明，Cu2+脅迫影響了對蝦的體色(Martínezetal.，2014)、存活和繁殖(Rao & Anjaneyulu，2008)，造成鰓和肝胰腺的組織損傷(Frías-Espericuetaetal.，2008)，增加了對病菌的易感性，降低其免疫功能(Yehetal.，2004)。當蝦類處于脅迫狀態(tài)時，其血細胞中的細胞凋亡率、活性氧(ROS)含量、一氧化氮(NO)含量和酯酶活性都會發(fā)生改變(Xianetal.，2010，2013；Guoetal.，2013；郭慧等，2015)，因此可根據(jù)這些指標的變化來判斷機體的免疫狀態(tài)。Caspase-3是細胞凋亡關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮主導(dǎo)功能，α2巨球蛋白(α-2M)被認為參與了蝦類的先天性免疫，而目前關(guān)于Cu2+脅迫下羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii血細胞參數(shù)和caspase-3以及α-2M基因表達量的研究尚未見報道。因此，本文擬采用流式細胞術(shù)和實時熒光定量PCR的方法，研究Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血細胞中細胞凋亡率、ROS含量、NO含量、酯酶活性以及caspase-3和α-2M基因表達量的影響，為進一步探究Cu2+脅迫對蝦類毒性效應(yīng)提供參考。

羅氏沼蝦，又名大頭蝦、馬來西亞大蝦，是目前世界上養(yǎng)殖量最大的三大蝦種之一，也是我國重要的經(jīng)濟甲殼動物，在水生態(tài)系統(tǒng)中分布較為廣泛，江河、湖泊等淡水和河口半咸水水域中均有分布，對水環(huán)境中各種理化性質(zhì)的變化反應(yīng)較靈敏(吳維福等, 2014)。因此，開展重金屬Cu2+對羅氏沼蝦毒性效應(yīng)的研究具有重要的實踐意義，為水環(huán)境毒理學(xué)和生態(tài)風(fēng)險評價的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用羅氏沼蝦購自湛江某養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為10.89 g±1.42 g，性成熟，非繁殖期。選取大小均勻、體色正常、附肢完整、活力強、無病患且處于蛻皮間期的個體用于實驗。將羅氏沼蝦在實驗室循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)于溫度為26 ℃±2 ℃的淡水中2周，所有水質(zhì)指標均符合《漁業(yè)水質(zhì)標準》的要求(國家海洋局，1989)，暫養(yǎng)及脅迫實驗期間24 h不間斷充氧。暫養(yǎng)期間每日06∶00和18∶00按蝦體質(zhì)量的2%投喂2次，脅迫實驗前24 h停止喂食。

2’，7’-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)、DAF-FM DA購自Sigma公司；二乙酸熒光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)、Annexin V FITC/PI(碘化丙啶)凋亡檢測試劑盒、總RNA提取試劑Trizol、瓊脂糖購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、rTaq PCR試劑盒、焦炭酸二乙酯(DEPC)、DL2000 Ladder Marker、熒光定量試劑盒(SYBR Green QPCR Super Mix-UDG)購自TaKaRa公司；核酸染料EB替代物、PCR Premix Taq、DNA ladder、6×loading buffer購自東盛公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，所用引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 脅迫實驗

實驗設(shè)對照組和脅迫組，每組3個重復(fù)。根據(jù)前人研究(Chen & Wang，2001；Mahmoodetal.，2009)及預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置理論脅迫濃度為0(對照組)、100 μg·L-1(脅迫組)，用硫酸銅配置Cu2+溶液。將羅氏沼蝦置于塑料箱中，每桶25尾，脅迫組加入180 L硫酸銅溶液。每24 h換水50%。分別在脅迫后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h從每桶中隨機選取3尾(n=9)羅氏沼蝦，參照Guo等(2015)的方法收集血淋巴。

1.3 血細胞懸液的制備

用2 mL的一次性注射器吸取冰上預(yù)冷的抗凝劑(葡萄糖20.5 g·L-1，檸檬酸鈉8 g·L-1，氯化鈉4.2 g·L-1，調(diào)pH至7.5) 200 μL，然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴至1.5 mL離心管中，取200 μL用預(yù)冷的抗凝劑稀釋血細胞濃度約為1×106個/mL，用于流式細胞術(shù)指標的檢測；余下的血淋巴在800 g、4 ℃離心10 min，棄上清，將血細胞重懸于Trizol中，-80 ℃保存，用于基因表達量分析。

1.4 流式細胞儀及參數(shù)設(shè)置

實驗所用流式細胞儀為美國BD (Becton Dickinson)公司生產(chǎn)的FACSVerse，數(shù)據(jù)獲取和分析軟件為Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)。每個樣品均獲取10 000個細胞。異硫氰酸熒光素(FITC)、FDA、DCF、DAF用綠色熒光通道(第一熒光通道，F(xiàn)L1)獲取熒光數(shù)據(jù)。PI檢測用第二熒光通道(FL2)獲取熒光數(shù)據(jù)。

1.5 血細胞凋亡率

參照冼健安等(2015)的方法，以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測血細胞的凋亡率。取200 μL血細胞懸液，加入2.5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI工作液，輕輕震蕩混勻，避光染色15 min后加入50 μL 5×Annexin V結(jié)合緩沖液，200目篩網(wǎng)過濾后立即上機檢測。結(jié)果以Annexin V-FITC和PI雙參數(shù)散點圖顯示，設(shè)門劃分細胞類群：活細胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于左下象限，前期凋亡細胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于右下象限，后期凋亡細胞和死細胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于右上象限。從樣品制備到上樣的整個過程應(yīng)控制在30 min以內(nèi)，以避免血細胞離體時間過長對結(jié)果造成不良影響。

1.6 ROS含量的測定

以DCFH-DA為標記探針檢測ROS含量。取200 μL血細胞懸液，加入DCFH-DA工作液10 μL，混勻后避光孵育30 min，200目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。

1.7 NO含量測定

以DAF-FM DA為標記探針檢測NO含量。取血細胞懸液200 μL，加入10 μM的DAF-FM DA工作液，混勻后避光孵育60 min，200目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。

1.8 酯酶活性

采用非特異脂溶性底物FDA進行酯酶活性測定。取血細胞懸液200 μL，加入5 μM FDA，混勻后避光孵育30 min，用200目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。

1.9 基因表達

血細胞總RNA的提取參照Trizol (Invitrogen)說明書進行，cDNA的合成按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒說明書進行。引物序列均來自美國國家生物技術(shù)信息中心(National center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫，利用Premier Primer 5.0設(shè)計引物。引物序列如表1所示。熒光定量PCR使用TaKaRa公司的SYBR Premix EX Taq試劑盒，按說明書操作。熒光定量PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，40個循環(huán)。在PCR反應(yīng)過程中，設(shè)計用滅菌超純水代替cDNA模板的陰性對照，每個樣品至少設(shè)置3個重復(fù)。擴增結(jié)束后啟動熔解曲線收集程序，根據(jù)熔解曲線的溫度判斷擴增過程的特異性并對擴增曲線進行分析。所得數(shù)據(jù)以ABI 7500 SDS進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量(Guoetal.，2015)。

表1 實時熒光定量引物

1.10 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進行配對t檢驗，統(tǒng)計結(jié)果均表示為平均值±標準差(Mean±SD)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Pearson分析ROS和NO含量與血細胞凋亡率之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 血細胞凋亡率

在脅迫后的3 h，Cu2+對血細胞凋亡率無顯著影響，在脅迫后的6～48 h，血細胞凋亡顯著升高，在48 h時達到39.01%，是對照組的5.38倍(圖1)。

圖1 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血細胞凋亡率的影響

*P<0.05，下同the same below.

2.2 ROS含量

ROS含量的變化趨勢和血細胞凋亡率較為一致(圖2)，在脅迫后的3 h，ROS含量無顯著變化(P>0.05)，在脅迫后的6～48 h，ROS的含量顯著升高(P<0.05)，在48 h由對照組的86.32上升到106.31。

圖2 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血細胞ROS含量的影響

2.3 NO含量

Cu2+對羅氏沼蝦血細胞中NO含量的影響如圖3所示，在脅迫的3 h，NO含量變化不顯著(P>0.05)，在脅迫后的6～48 h，NO含量持續(xù)增加，并與對照組有顯著性差異(P<0.05)，最高值出現(xiàn)在48 h，為126.08。

圖3 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血細胞一氧化氮含量的影響

2.4 酯酶活性

酯酶活性在脅迫后的3～48 h都呈顯著下降的趨勢(P<0.05)，最低值出現(xiàn)在48 h，由對照組的117.78下降到88.40(圖4)。

圖4 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血細胞酯酶活性的影響

2.5 ROS含量與血細胞凋亡率的相關(guān)性

在脅迫48 h后，ROS含量與血細胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.83(圖5)。

圖5 ROS含量和血細胞凋亡率的相關(guān)性(n=36)

2.6 NO含量與血細胞凋亡率的相關(guān)性

在脅迫48 h后，NO含量與血細胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.93(圖6)。

圖6 NO含量和血細胞凋亡率的相關(guān)性(n=36)

2.7caspase-3相對基因表達量

在脅迫后的3 h，Cu2+對羅氏沼蝦caspase-3的相對基因表達量無影響，在脅迫后的6～48 h，caspase-3的相對基因表達量均顯著增加(P<0.05)，并在24 h達到最高值，由對照組的1.01增加到1.56(圖7)。

圖7 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦caspase-3相對基因表達量的影響

2.8α-2M相對基因表達量

在脅迫后的0～6 h，Cu2+對羅氏沼蝦α-2M基因表達量無影響，在脅迫后的12 h，α-2M基因的表達量顯著升高(P<0.05)并達到峰值，24 h時有短暫的降低，但與對照組相比仍有顯著增加的趨勢(P<0.05)，在48 h，α-2M基因的表達量顯著降低(P<0.05)(圖8)。

圖8 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦α-2M相對基因表達量的影響

3 討論

血細胞在甲殼動物的免疫功能中起著舉足輕重的作用(Havanapanetal.，2016)，血細胞參數(shù)和血細胞凋亡率是評價機體免疫、生理狀態(tài)和細胞過程的重要指標(Xianetal.，2010；Silva-Aciareetal.，2013)，血細胞的損傷會降低免疫功能，甚至?xí){蝦類的生存(Lorenzonetal.，1999；Xianetal.，2010)。據(jù)報道，受溫度(Changetal.，2009)、亞硝酸鹽(Guoetal.，2013)和脂多糖(Xianetal.，2013)等非生物因素刺激時，凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei和斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon的血細胞凋亡率均顯著增加。本文的研究也發(fā)現(xiàn)，在受到Cu2+脅迫時，羅氏沼蝦的血細胞凋亡率也顯著增加，說明當蝦類受到各種環(huán)境因子脅迫時，可誘導(dǎo)血細胞發(fā)生凋亡。

ROS是一類高活性的化學(xué)物質(zhì)，參與了細胞存活、生長、增殖和分化，并在先天性免疫防御機制中發(fā)揮重要作用(Yangetal.，2013)，正常情況下ROS的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)。當機體受到外界刺激或病菌感染時，細胞會行使功能吞噬外來物，在行使吞噬功能的過程中，細胞還會產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)(如ROS)抑制或殺死外來物。而持續(xù)不斷的刺激會使ROS含量迅速上升，打破了機體內(nèi)ROS含量的平衡，過高的ROS含量對細胞自身造成傷害，甚至導(dǎo)致細胞凋亡(Gill & Tuteja，2010)。NO 是一種廣泛存在于各組織器官中的重要信使分子，能維持體內(nèi)微循環(huán)內(nèi)環(huán)境恒定和保護機體非特異性免疫功能(汪義軍，1997)。研究表明，ROS 和NO具有協(xié)同作用，共同調(diào)控應(yīng)答脅迫反應(yīng)的基因表達(Scheleretal.，2013)。NO和ROS都具有雙重的生理效應(yīng)，低濃度的NO和ROS可以抑制細胞凋亡，對機體是有益的，而高濃度的ROS和NO會對機體產(chǎn)生嚴重的傷害，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生(Simonetal.，2000；Brown，2010)。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ROS、NO和血細胞凋亡率的Pearson相關(guān)性系數(shù)分別為0.83和0.93，進一步驗證了ROS和NO會誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。

酯酶是一種廣泛存在于各種細胞內(nèi)的水解酶，與外源性物質(zhì)的消除和降解有關(guān)，雖然并不直接參與重金屬的解毒，但酯酶系統(tǒng)的狀態(tài)反映了機體抵抗外界不良環(huán)境的能力(Zverevaetal.，2003)。因此，酯酶是毒理學(xué)領(lǐng)域具有重要意義的一種酶(Rashidetal.，2013)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，被用作檢測藥物殘留的“指示器”(Begumetal.，2008)，也用于檢測細胞活性。當細胞的酯酶活性下降時，被認為是細胞活性下降，會導(dǎo)致細胞凋亡(郭慧等，2015)。研究表明，斑節(jié)對蝦在受到Cd2+刺激時，血細胞中的酯酶活性顯著降低(Xianetal.，2014)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在受到Cu2+脅迫時，羅氏沼蝦血細胞的酯酶活性也被顯著抑制。在脅迫3 h后，酯酶的活力開始顯著降低，至48 h時，由對照組的117.78顯著下降到88.40。酯酶活性的降低與ROS、NO和細胞凋亡率的升高大體一致。郭慧等(2015)對亞硝酸鹽脅迫下凡納濱對蝦的血細胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，酯酶活性在24 h才開始顯著降低，這可能與脅迫因子和實驗對象不同有關(guān)。

Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮主導(dǎo)功能，因此，細胞或組織中Caspase-3的活性是檢測細胞是否發(fā)生凋亡的重要方法(Zverevaetal.，2003)。對caspase-3進行RNA干擾以后，對蝦的死亡率顯著降低(Rijiravanichetal.，2008)，說明caspase-3在細胞凋亡中有著舉足輕重的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫的12 h、24 h和48 h，caspase-3的表達量均顯著升高，24 h達到峰值后在48 h略降低，caspase-3的這種表達模式與低溫脅迫下凡納濱對蝦血細胞中caspase-3的表達模式類似，即都在表達高峰后出現(xiàn)輕微降低，但與對照組相比仍有顯著差異(Changetal.，2009)。caspase-3表達量的顯著升高在12 h出現(xiàn)，而ROS和NO的顯著升高是在6 h，推測是ROS和NO的升高誘導(dǎo)了caspase-3的表達。

α-2M是一種在無脊椎動物中參與宿主防御機制的非特異性蛋白酶抑制劑(Shanthi & Vaseeharan，2014)，在抑制和清除有害蛋白酶的過程中發(fā)揮重要作用(Gonias，1992)。據(jù)報道，羅氏沼蝦、保羅美對蝦Farfantepenaeuspaulensis和印度明對蝦Fenneropenaeusindicus在注射細菌、真菌和病毒后，血細胞中α-2M的表達量被顯著誘導(dǎo)，認為α-2M與蝦類的先天免疫有關(guān)(Hoetal.，2009；Perazzoloetal.，2011；Shanthi & Vaseeharan，2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫下，α-2M的表達量發(fā)生了顯著變化，推測甲殼動物的α-2M表達模式不僅可以被微生物和病毒調(diào)控，還會受到重金屬脅迫的影響。α-2M的表達量在12 h和24 h時顯著上升，并在24 h達到峰值，在48 h又顯著下降，推測在Cu2+脅迫早期，血細胞中的α-2M被激活參與到機體的免疫反應(yīng)中，在脅迫48 h時，血細胞中的NO和ROS含量以及血細胞的凋亡比例都達到最高值，此時機體的免疫功能顯著降低，因此α-2M的表達量也受到顯著抑制。

綜上所述，在Cu2+脅迫下，機體的酯酶活性受到顯著抑制，免疫功能受到影響，機體通過誘導(dǎo)NO和ROS的產(chǎn)生以及免疫相關(guān)基因α-2M的表達來對抗Cu2+脅迫帶來的損傷。隨著脅迫時間的延長，過高濃度的NO和ROS對機體自身造成了氧化損傷，誘導(dǎo)了凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達，導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生，說明Cu2+對蝦類具有免疫抑制性和毒性。相關(guān)性分析表明，NO和ROS的升高可能是細胞凋亡的主要誘因。

郭慧, 冼健安, 王安利. 2015. 亞硝酸鹽對凡納濱對蝦血細胞毒性及p53基因表達的影響[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 36(2)： 61-67.

國家海洋局. 1989. 漁業(yè)水質(zhì)標準[M]. 北京： 中國標準出版社.

汪義軍. 1997. 體內(nèi)一氧化氮含量測定的幾種方法[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, (1)： 7-9.

吳維福, 陳孌孌, 李郁嬌, 等. 2014. 三丁基錫對羅氏沼蝦血清中免疫酶活力的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報, 34(3)： 17-21.

冼健安, 錢坤, 郭慧, 等. 2015. 雜色鮑血細胞分類、結(jié)構(gòu)和免疫功能的流式細胞術(shù)分析[J]. 海洋科學(xué), 39(12)： 8-14.

Begum R, Bhadra SC, Shahjahan R,etal. 2008. Esterase banding pattern in different tissues ofPangasiushypophthalmus(Sauvage, 1878)[J]. Bangladesh Journal of Zoology, 36： 287-294.

Bharadwaj AS, Patnaik S, Browdy CL,etal. 2014. Comparative evaluation of an inorganic and a commercial chelated copper source in Pacific white shrimpLitopenaeusvannamei(Boone) fed diets containing phytic acid[J]. Aquaculture, 422-423(3)： 63-68.

Brown GC. 2010. Nitric oxide and neuronal death[J]. Nitric Oxide, 23(3)： 153-165.

Chang CC, Yeh MS, Cheng W. 2009. Cold shock-induced norepinephrine triggers apoptosis of haemocytes via caspase-3 in the whiteshrimp,Litopenaeusvannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology, 27(6)： 695-700.

Chen W, Wang CH. 2001. The susceptibility of the giant freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergiitoLactococcusgarvieaeand its resistance under copper sulfate stress[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 47(2)： 137-144.

Frías-Espericueta MG, Castro-Longoria R, Barrón-Gallardo GJ,etal. 2008. Histological changes and survival ofLitopenaeusvannameijuveniles with different copper concentrations[J]. Aquaculture, 278(1-4)： 97-100.

Gill SS, Tuteja N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 48(12)： 909-930.

Gonias SL. 1992. Alpha 2-macroglobulin： a protein at the interface of fibrinolysis and cellular growth regulation[J]. Experimental Hematology, 20(3)： 302-311.

Guo H, Miao YT, Xian JA,etal. 2015. Expression profile of antioxidant enzymes in hemocytes from freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergiiexposed to an elevated level of copper[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 95(4)： 447-451.

Guo H, Xian JA, Li B,etal. 2013. Gene expression of apoptosis-related genes, stress protein and antioxidant enzymes in hemocytes of white shrimpLitopenaeusvannameiunder nitrite stress[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C： Toxicology & Pharmacology, 157(4)： 366-371.

Havanapan PO, Taengchaiyaphum S, Ketterman AJ,etal. 2016. Yellow head virus infection in black tiger shrimp reveals specific interaction with granule-containing hemocytes and crustinPm1 as a responsive protein[J]. Developmental & Comparative Immunology, 54(1)： 126-136.

Ho PY, Cheng CH, Cheng W. 2009. Identification and cloning of the α2-macroglobulin of giant freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergiiand its expression in relation with the molt stage and bacteria injection[J]. Fish & Shellfish Immunology, 26(3)： 459-466.

Liao CM, Chang CF, Yeh CH,etal. 2006. Metal stresses affect the population dynamics of disease transmission in aquaculture species[J]. Aquaculture, 257(1-4)： 321-332.

Lorenzon S, de Guarrini S, Smith VJ,etal. 1999. Effects of LPS injection on circulating haemocytes in crustaceansinvivo[J]. Fish & Shellfish Immunology, 9(1)： 31-50.

Mahmood K, Yang JS, Chen D,etal. 2009. Response of metallothionein gene-1 to laboratory exposure to heavy metals and thermal stress in the freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergii[J]. Journal of Hazardous Materials, 167(1-3)： 523-530.

Martínez A, Romero Y, Castillo T,etal. 2014. The effect of copper on the color of shrimps： redder is not always healthier[J]. PLoS ONE, 9(9)： e107673.DOI: 10.1371/journal.pone.0107673.

Perazzolo LM, Bachère E, Rosa RD,etal. 2011. Alpha2-macroglobulin from an Atlantic shrimp： biochemical characterization, sub-cellular localization and gene expression upon fungal challenge[J]. Fish & Shellfish Immunology, 31(6)： 938-943.

Rao MS, Anjaneyulu N. 2008. Effect of copper sulfate on molt and reproduction in shrimpLitopenaeusvannamei[J]. International Journal of Biological Chemistry, 2(1)： 35-41.

Rashid MA, Begum RA, Shahzahan RM. 2013. Tissue distribution of esterase isozymes and their responses to cypermethrin in three macrobrachium species[J]. Journal of the Asiatic Society of Bangladesh, Science, 38(2)： 227-235.

Rijiravanich A, Browdy CL, Withyachumnarnkul B. 2008. Knocking down caspase-3 by RNAi reduces mortality in Pacific white shrimp penaeusLitopenaeusvannameichallenged with a low dose of white-spot syndrome virus[J]. Fish & Shellfish Immunology, 24(3)： 308-313.

Santos MHS, Cunha NTD, Bianchini A. 2000. Effects of copper and zinc on growth, feeding and oxygen consumption ofFarfantepenaeuspaulensispostlarvae (Decapoda： Penaeidae)[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 247(2)： 233-242.

Scheler C, Durner J, Astier J. 2013. Nitric oxide and reactive oxygen species in plant biotic interactions[J]. Current Opinion in Plant Biology, 16(4)： 534-539.

Shanthi S, Vaseeharan B. 2014. Alpha 2 macroglobulin gene and their expression in response to GFP taggedVibrioparahaemolyticusand WSSV pathogens in Indian white shrimpFenneropenaeusindicus[J]. Aquaculture, 418-419(1)： 48-54.

Silva-Aciares F, Moraga D, Riquelme C. 2013. Effect of copper on the immunomodulatory activities of haemocytes in juveniles of the abaloneHaliotisrufescenscultivated under hatchery conditions[J]. Aquaculture, 410-411： 72-78.

Simon HU, Haj-Yehia A, Levi-Schaffer F. 2000. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction[J]. Apoptosis, 5(5)： 415-418.

Valavanidis A, Vlachogianni T. 2012. Metal pollution in ecosystems. Ecotoxicology studies and risk assessment in the marine environment[J]. Science Advances on Environment, Toxi-Cology & Ecotoxicology Issues.

Wang SL, Xu XR, Sun YX,etal. 2013. Heavy metal pollution in coastal areas of south China： a review[J]. Marine Pollution Bulletin, 76(1-2)： 7-15.

Wang ZH, Feng J, Nie XP. 2015. Recent environmental changes reflected by metals and biogenic elements in sediments from the Guishan Island, the Pearl River Estuary, China[J]. Estuarine Coastal & Shelf Science, 164(1-April)： 493-505.

Xian JA, Li B, Guo H,etal. 2014. Haemocyte apoptosis of the tiger shrimpPenaeusmonodonexposed to cadmium[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 92(5)： 525-528.

Xian JA, Miao YT, Li B,etal. 2013. Apoptosis of tiger shrimp (Penaeusmonodon) haemocytes induced byEscherichiacolilipopolysaccharide[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A： Molecular & Integrative Physiology, 164(2)： 301-306.

Xian JA, Wang AL, Ye CX,etal. 2010. Phagocytic activity, respiratory burst, cytoplasmic free-Ca2+concentration and apoptotic cell ratio of haemocytes from the black tiger shrimp,Penaeusmonodonunder acute copper stress[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C： Toxicology & Pharmacology, 152(2)： 182-188.

Yang Y, Bazhin AV, Werner J,etal. 2013. Reactive oxygen species in the immune system[J]. International Reviews of Immunology, 32(3)： 249-270.

Yeh ST, Liu CH, Chen JC. 2004. Effect of copper sulfate on the immune response and susceptibility toVibrioalginolyticusin the white shrimpLitopenaeusvannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology, 17(5)： 437-446.

Zvereva E, Serebrov V, Glupov V,etal. 2003. Activity and heavy metal resistance of non-specific esterases in leaf beetleChrysomelalapponicafrom polluted and unpolluted habitats[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C： Toxicology & Pharmacology, 135(4)： 383-391.

Effects of Cu2+Stress on Hemocytes Toxicity andcaspase-3,α-2MGene Expression inMacrobrachiumrosenbergii

GUO Hui, ZHU Xiaowen, OU Ronghua, LU Zhicheng, TAN Cuiting, SHEN Yuchun, ZHU Chunhua*

(Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang, College of Fisheries,Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong Province 524025, China)

The present study analyzed the toxic effects of Cu2+on apoptotic cell ratio, ROS production, esterase activities, NO production, and the expression levels ofcaspase-3 andα-2Min hemocytes ofMacrobrachiumrosenbergii. The results showed that the changes of apoptotic cell ratio were consistent with ROS production which was increased significantly (P<0.05) after exposure for 6～48 h. Esterase activities were significantly decreased (P<0.05) at 3～48 h and the minimum was observed at 48 h. The NO production continued increasing and the level became significant difference (P<0.05) after exposure for 6～48 h. The relative expression levels ofcaspase-3 were significantly induced (P<0.05) after exposure for 6～48 h, and reached the peak at 24 h. The relative expression ofα-2Mwas significantly increased (P<0.05) and reached the peak at 12 h. Moreover, the expression level ofα-2Mreduced after exposure for 24 h and became significantly different(P<0.05) at 48 h. Correlation analysis showed that significant positive correlation (P<0.001) between apoptotic cell ratio and ROS production was observed, as well as apoptotic cell ratio and NO production. All these results suggested that esterase activities were significantly inhibited after Cu2+exposure, while NO and ROS production as well asα-2Mexpression were induced against Cu2+exposure. Along with stress time increasing, overfull production of ROS and NO caused oxidative stress to prawn and then induced the expression level ofcaspase-3 which finally resulted in apoptosis, indicating that Cu2+stress may have immunosuppressive and toxic effects toM.rosenbergii, and the increased production of NO and ROS might be the main cause of apoptosis.

Macrobrachiumrosenbergii； Cu2+； hemocytes toxicity； gene expression； apoptosis

2017-02-08 接受日期：2017-03-14

國家自然科學(xué)基金項目(31600321)； 廣東省自然科學(xué)基金項目(2015A030310438)； 廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強校工程科研項目(GDOU2016050253)； 廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師特別資助計劃項目(HDYQ2015003)

郭慧(1986—)， 女， 講師， 博士， 主要從事水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究， E-mail：guohuivivian@163.com

*通信作者Corresponding author， 男， 教授， 主要從事水域生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境研究， E-mail：zhu860025@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20170035

X503.225； Q959.223

A

1000-7083(2017)03-0293-07