吳 梅,劉 燕,李庭喜,段 平,肖 春*

(1.云南農業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南中醫(yī)學院 中藥學院，云南 昆明 650500)

一種馬鈴薯塊莖蛾卵的計數新方法

吳 梅1,2,劉 燕1,李庭喜2,段 平2,肖 春1*

(1.云南農業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南中醫(yī)學院 中藥學院，云南 昆明 650500)

為了解決常規(guī)馬鈴薯塊莖蛾卵計數過程中存在的工作量大、卵聚集程度高時計數不準確等，建立了一種新的卵粒計數方法，即采用70%乙醇浸泡卵30 min，用毛筆輕輕刷下，再置于顯微鏡下計數。經過方法學考察，洗脫計數法的準確性高、精密度、重復性好、操作簡便，可用于馬鈴薯塊莖蛾卵粒的計數。

馬鈴薯塊莖蛾；卵粒；計數方法

馬鈴薯塊莖蛾[Phthorimaeaoperculella(Zeller)]又名煙草潛葉蛾，屬鱗翅目，麥蛾科(以下簡稱PTM)。原產于南美洲，目前已發(fā)展成為一種世界性害蟲，在我國也擴展到西南、西北、中南、華東10余個省、自治區(qū)，且發(fā)生較為普遍[1-2]。

云南農業(yè)大學植保學院是我國較早開展PTM防治研究的單位之一，本實驗室已有成熟的PTM人工續(xù)代飼養(yǎng)方法，為相關科研工作提供充足的蟲源。在實驗過程中，經常需要對PTM產卵量進行計數。PTM的卵橢圓形，微透明，卵的平均長、寬分別為(0.40±0.02) mm和(0.30±0.01) mm，初產時乳白色，孵化前變成黑褐色。由于卵粒較小，需要在顯微鏡下觀察計數，而PTM單雌產卵量可達150～200粒[3]，使得卵的計數工作量很大、耗時較長。此外，PTM產卵的習性，如常出現卵聚集、疊壓的情況，在馬鈴薯塊莖上多產于芽眼、破皮下或縫隙中，隱蔽性較強。在實驗過程中除了在馬鈴薯、濾紙上產卵，還會在容器壁等處產卵等，上述情況使得用常規(guī)直接計數方法既不易也很難保證其準確性。鱗翅目昆蟲產卵分泌物的基本功能是包裹卵并將卵固定，分泌物成分復雜，主要是水，還有蛋白質、游離氨基酸、碳水化合物等[4-5]。本研究旨在尋找一種新的準確性高、精密度及重現性好、簡便易行的方法，確保實驗數據準確并達到減少工作量目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試蟲卵 馬鈴薯塊莖蛾飼養(yǎng)于云南農業(yè)大學植物保護學院養(yǎng)蟲室，飼養(yǎng)條件為：(27±2) ℃，相對濕度50%～70%，L/D=14 h/10 h。收集成蟲于1 L玻璃燒杯中，喂以10%蜂蜜水，杯口用24目紗網封口，上置濾紙，用以收集蟲卵。

1.1.2 儀器與試劑 顯微鏡：XTL-2400(梧州奧卡光學儀器有限公司)。乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚(30～60 ℃)均為化學純，蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶劑及浸泡時間的選擇

1.2.1.1 預實驗 將產有卵的濾紙浸泡于水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚等不同溶劑中，用毛筆輕輕刷拭，只有乙醇可將卵洗下，故選擇乙醇作為供試溶液。

1.2.1.2 溶劑及處理時間的選擇 溶劑選擇了3個濃度的乙醇溶液，分別為無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇；浸泡時間考察了10、30、60 min。將產有卵的濾紙置顯微鏡下觀察，直接數卵粒的數量(即直接計數)。再將上述濾紙放入玻璃培養(yǎng)皿中，倒入溶劑浸泡，然后用毛筆輕輕將卵從濾紙上刷下，將培養(yǎng)皿傾斜，使卵集中于一側，吸去多余溶劑，留下少許溶劑保持卵的濕潤又不會使卵隨意流動，置顯微鏡下觀察計數(即洗脫計數)。每組重復3次，計算卵的洗脫率。

1.2.1.3 實驗數據處理 卵的洗脫率=∑卵量(洗脫計數)/∑卵量(直接計數)

當卵量(洗脫計數)>卵量(直接計數)時，按后者計。

1.2.2 方法學考察

1.2.2.1 準確度實驗 根據卵粒分布情況分為聚集組和離散組，離散組又根據卵量多少分為高卵量組、中卵量組、低卵量組，卵量分別為50～100、20～50、0～20粒，每組3個重復。按照1.2.1.2所確定的方法進行操作，將卵量(直接計數)視為真實值，計算準確率。

1.2.2.2精密度實驗 按照1.2.2.1進行分組和操作，每個實驗重復計數6次，計算RSD%(n=6)。

1.2.2.3重復性實驗 按照1.2.2.1進行分組和操作，每個實驗由3個人分別計數，計算RSD%(n=3)。

2 結果與分析

2.1 溶劑及浸泡時間的選擇

實驗結果表明，溶劑是對卵洗脫率的主要影響因素，其中70%乙醇對卵有較好的洗脫率。在該濃度下，不同浸泡時間對卵均有較高的洗脫率，考慮到節(jié)約時間并確保卵的洗脫，確定70%乙醇浸泡卵30 min為最佳實驗條件(表1)。

表1 溶劑及浸泡時間對卵洗脫率的影響

2.2 方法學考察

2.2.1 準確度實驗 直接計數與洗脫計數所測卵量見圖1，實驗結果以常規(guī)直接計數法所測卵量為標準。用洗脫計數法測定離散型分布的卵粒平均準確率為98.1%，此類型卵量的多少對準確率的影響不大。聚集型分布的卵粒所測結果的準確率受聚集卵粒的多少及密集程度的影響，如聚2、聚3為聚集在一起的卵粒不多的情況，所測結果與直接計數法十分接近；而聚1為聚集的卵粒多且整齊地排列成兩層，所測結果與直接計數法相差較大，但此結果并不能說明洗脫計數法不準確，在此情況下，直接計數法所測卵量并不是真實值，因為上層可以計數而下層看不見，就只能根據經驗估計；而在洗脫計數法中，70%乙醇溶液浸泡可使卵發(fā)生蛋白質變性，卵變得有彈性而不易破碎，可在顯微鏡下用解剖針將聚集在一起的卵分開，并可撥動以觀察各個面，計數更為準確。所以采用將卵在70%乙醇中浸泡30 min后，再將卵洗脫下來計數，結果準確度高。

圖1 直接計數法與洗脫計數法所測卵量對比

2.2.2 精密度實驗 實驗結果表明，洗脫計數法的精密度高，而常規(guī)直接計數法在卵粒多而密集的情況下精密度較差(表2)。

表2 精密度實驗結果(RSD%，n=6)

2.2.3 重復性實驗 實驗結果表明，洗脫計數法有較好重復性，而常規(guī)直接計數法在卵粒多而密集的情況下的重復性較差(表3)。

表3 重復性實驗結果(RSD%，n=3)

3 討論

本方法準確性高、精密度及重復性好、操作簡便，可用于馬鈴薯塊莖蛾卵粒的計數。本方法的關鍵環(huán)節(jié)在于卵粒的洗脫，70%乙醇浸泡30 min可使卵粒有較高的洗脫率。只要能將卵粒都洗脫下來，置顯微鏡下計數就很容易了，一方面由于卵的蛋白質變性，卵由半透明變成白色，方便觀察；另一方面，卵集中在一起，1～2個視野下就可數完。

本實驗采用的是產在濾紙上的卵，而實驗中馬鈴薯塊莖蛾的卵還可能產在馬鈴薯、燒杯等容器壁上，都可以使用本方法進行卵粒的計數。燒杯等容器可裝滿70%乙醇浸泡，由于杯壁比濾紙更光滑，卵粒易被洗脫，且卵粒較重，沉于容器底部，可用吸管將其吸取轉移到培養(yǎng)皿中；馬鈴薯上的卵由于多分布于芽眼、破皮下或裂縫中，難以用毛筆刷下，可將未刷下的卵粒連同少量馬鈴薯塊莖切下，在顯微鏡下，用解剖針將卵粒慢慢剝離出，耗時會較長，但準確性高，此外，實驗時挑選光滑、無起皮、無傷口的馬鈴薯，可大大降低馬鈴薯上卵粒計數的難度。

[1] 丁錦華,洪曉月.農業(yè)昆蟲學(第二版)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2007:144-146.

[2] 農業(yè)部外業(yè)入侵生物預防與控制研究中心.中國主要農林入侵物種與控制(第1輯)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2004:27-29.

[3] Devi M B D A. Biology of potato tuber mothPhthorimaeaopercullela(Zeller)[J]. Ann. Pl. Protec. Sci., 2015, 21(2): 276-278.

[4] 金鳳,嵇保中,劉曙雯,等.昆蟲產卵分泌物的產生方式、成分及功能[J].昆蟲學報,2009,52(9):1008-1016.

[5] 朱保健,劉朝良,董勝張,等.家蠶蛾粘液腺及其分泌物的初步研究[J].蠶業(yè)科學,2003,29(4):436-438.

(責任編輯：曾小軍)

A New Method for Counting of Eggs of Potato Tuber Moth

WU Mei1,2, LIU Yan1, LI Ting-xi2, DUAN Ping2, XIAO Chun1*

(1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;2. College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China)

In order to overcome the shortcomings of the conventional method for the counting of eggs of potato tuber moth, such as large workload, inaccurate counting results due to the high gathering of eggs, this research established a new method for the counting of eggs of potato tuber moth: soaking eggs in 70% ethanol solution for half an hour, then brushing the eggs down gently by brush pen, finally counting them under a microscope. The methodological survey proves that this method is accurate, precise, repeatable and simple, and it can be applied to count the eggs of potato tuber moth.

Potato tuber moth; Egg; Counting method

2017-02-22

國家自然科學基金(31560607)。

吳梅(1975─)，女，云南昆明人，博士研究生，從事昆蟲化學生態(tài)方面研究。*通訊作者：肖春。

S435.32

A

1001-8581(2017)06-0063-03