殷津津，辛文妤

1.山東省青島市城陽區(qū)惜福鎮(zhèn)街道衛(wèi)生院藥劑科，山東青島266106；2.山東省濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003

LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW 264.7細(xì)胞分泌NO的比較

殷津津1，辛文妤2

1.山東省青島市城陽區(qū)惜福鎮(zhèn)街道衛(wèi)生院藥劑科，山東青島266106；2.山東省濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003

目的研究LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO的劑量、時(shí)間依賴性關(guān)系，為建立炎癥細(xì)胞模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法以LPS（0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL）、TNF-α（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或IL-1β（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液Greiss法測(cè)定NO的含量。以LPS（1μg/mL）、TNF-α（10 ng/mL）或IL-1β（10 ng/mL）分別刺激RAW264.7細(xì)胞6、12、24、48 h，收集細(xì)胞上清液Greiss法測(cè)定NO的含量。結(jié)果不同劑量LPS均可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌大量NO，無明顯的劑量依賴性，不同劑量TNF-α或IL-1β均可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO，且有一定的劑量依賴性，LPS（1μg/mL）或TNF-α（10 ng/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞12~48 h時(shí)NO的分泌量顯著升高，IL-1β（10 ng/mL）刺激6~48 h均可顯著誘NO的分泌，均具有一定的劑量依賴性。結(jié)論0.01~10.00μg/mL LPS、0.10~100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7細(xì)胞均可成功復(fù)制炎癥細(xì)胞模型。

炎癥、RAW 264.7細(xì)胞、LPS、TNF-α、IL-1β

炎癥是多種疾病的一個(gè)重要標(biāo)志特征，是機(jī)體對(duì)內(nèi)外有害刺激因素做出的自我保護(hù)性反應(yīng)。雖然炎癥在一定程度上對(duì)機(jī)體是有利的，但過度或過久的炎癥反應(yīng)往往會(huì)加重許多疾病的發(fā)展，如自身免疫性疾病、膿毒癥、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等[1-2]。巨噬細(xì)胞是一類重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞來源于小鼠腹腔，是可以永生化的巨噬細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定進(jìn)行傳代培養(yǎng)[4]。

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的的重要組成成分，是引起炎癥的一類重要誘導(dǎo)劑，LPS與其受體結(jié)合后通過一系列信號(hào)通路如NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的釋放[5]。以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞在一定程度上可以模擬機(jī)體的炎癥反應(yīng)，是目前常用的體外炎癥細(xì)胞模型[6-7]。此外，TNF-α、IL-1β是炎癥反應(yīng)中最常見的炎癥因子，TNF-α是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中的核心炎癥介質(zhì)，可誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型變?yōu)檠装Y型，導(dǎo)致機(jī)體代謝和血液動(dòng)力學(xué)改變，促進(jìn)炎癥介質(zhì)生成，是導(dǎo)致炎性因子“瀑布效應(yīng)”的“元兇”[8]。IL-1β是一種能夠激活多種免疫和炎癥細(xì)胞的前炎性細(xì)胞因子，在感染、炎癥、免疫應(yīng)激等細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用[9]。LPS、TNF-α、IL-1β均可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，用于抗炎藥物的篩選及其作用機(jī)制的評(píng)價(jià)。該文主要觀察不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間后NO分泌量的比較，為建立更理想的炎癥細(xì)胞模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7由該實(shí)驗(yàn)室前期凍存；LPS、TNF-α、IL-1β購自美國sigma公司。胰蛋白酶、胎牛血清購自美國sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在37℃、5% CO2、飽合濕度條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.2.2 不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的比較取剛剛長成完整單層的RAW264.7細(xì)胞一瓶，胰蛋白酶消化后吹打細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至2×105cell/mL。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板后吸掉原培養(yǎng)液，每孔加入190μL無血清培養(yǎng)液。6 h后加入10μLLPS（終濃度為0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL），或10μLTNF-α（終濃度為0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或10μL IL-1β（終濃度為0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL），另設(shè)正常對(duì)照組。然后于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)上清液，Greiss測(cè)定NO的含量。

取細(xì)胞上清液100μL加入到96孔板中，加入100μL Griess試劑（0.2%萘基乙二胺和含2%磺胺的0.5%磷酸按1:1比例混合），于微孔板振蕩器上振蕩使之混勻，室溫避光靜置10min，用酶標(biāo)儀于540 nm波長處測(cè)定吸光度值。計(jì)算NO分泌率=（樣品孔OD－空白孔OD）/（對(duì)照孔OD-空白孔OD）×100%。

1.2.3 LPS、TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間分泌NO的比較取RAW264.7細(xì)胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，用移液管吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至2×105cell/mL。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板后吸掉原培養(yǎng)液，每孔加入190μL無血清培養(yǎng)液。6 h后加入10μL LPS（終濃度為1μg/mL）或10μL TNF-α（終濃度為10 ng/mL）或10μL IL-1β（終濃度為10 ng/mL），另設(shè)正常對(duì)照組。加入LPS后，于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h。收集培養(yǎng)上清液，Griss測(cè)定NO的含量，計(jì)算NO分泌率=（樣品孔OD－空白孔OD）/（對(duì)照孔OD-空白孔OD）×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO的比較

正常對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞分泌NO的量極低，加入不同劑量的LPS、TNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量均顯著提高。加入0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL刺激后NO分泌量均顯著提高，隨著LPS劑量的增加，NO的分泌略微增加。加入0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mLTNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量均顯著提高；隨著TNF-α或IL-1β劑量的增加，NO的分泌量逐漸增加，且有一定的劑量依賴性（圖1）。

2.2 LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW 264.7細(xì)胞不同時(shí)間致NO分泌的變化

正常對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞分泌NO的量極低，加入LPS、TNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量顯著提高。與正常對(duì)照組相比，加入LPS或TNF-α6 h后NO分泌量略微提高，隨著LPS或TNF-α刺激時(shí)間的延長，NO分泌量逐漸增加，12、24、48 h組與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異，其中在48 h時(shí)NO分泌量達(dá)到高峰期。加入IL-1β在6、12、24、48 h與正常對(duì)照組相比均具有顯著性差異，其中在48 h時(shí)NO分泌量達(dá)到高峰期（圖2）。

3 討論

炎癥是十分常見而重要的基本病理過程，可發(fā)生于機(jī)體的任何部位和任何組織，參與人類的大多數(shù)疾病。目前臨床上常見抗炎藥物包括：非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類、生物制劑、中草藥制劑等。但這些藥物存在療效不確定、毒副作用明顯、價(jià)格昂貴等問題。因此，積極尋找有效、不良反應(yīng)低、能夠長期使用的抗炎藥物一直是醫(yī)藥工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。建立體外炎癥細(xì)胞模型具有簡單、高效、便捷等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此，以炎癥細(xì)胞為模型進(jìn)行抗炎藥物的篩選及評(píng)價(jià)成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。該文主要通過觀察不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間后NO的分泌量，尋找合適的刺激物劑量及刺激時(shí)間，為更好地進(jìn)行抗炎藥物的篩選及評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

圖1 不同劑量的LPS（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）

圖2 不同時(shí)間段內(nèi)加入LPS(A)、TNF-α(B)、IL-1β(C)

NO的過量生成與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是一種重要的炎癥介質(zhì)。正常情況下內(nèi)皮源性NO具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，而在病理情況下誘導(dǎo)型NO合成酶合成大量的NO則有細(xì)胞不良反應(yīng)，加重炎癥反應(yīng)，參與多種疾病的發(fā)展[10]。在該實(shí)驗(yàn)中，主要通過檢測(cè)NO的分泌量來評(píng)價(jià)LPS、TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)RAW 264.7成為炎癥細(xì)胞模型的標(biāo)準(zhǔn)。NO的測(cè)定采用Greiss法，該方法操作簡單，只需一步反應(yīng)，時(shí)間為10 min，并且價(jià)格低廉、靈敏度高、可用于大批量的藥物篩選或抗炎活性評(píng)價(jià)。因此，該實(shí)驗(yàn)選擇通過測(cè)定NO含量來初步評(píng)價(jià)炎癥細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS在0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL各劑量均可以刺激RAW264.7細(xì)胞分泌大量的NO，劑量依賴性不明顯。TNF-α、IL-1β在0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL各劑量均可以刺激RAW264.7細(xì)胞分泌大量的NO，且具有一定的劑量依賴性。

此外，該研究選取1μg/mL LPS、10 ng/mL TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7細(xì)胞的。結(jié)果顯示，LPS或TNF-α刺激6 h時(shí)NO的分泌量與正常對(duì)照組無顯著性差異，復(fù)制模型不成功；僅在12~48 h均可以成功復(fù)制模型；而IL-1β在6~48 h均可以刺激NO的大量分泌，有一定的時(shí)間依賴性，可成功復(fù)制模型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LPS多采用0.2~1μg/mL刺激RAW264.7細(xì)胞18-24 h進(jìn)行炎癥細(xì)胞模型的復(fù)制[11-13]。WeiweiLi等人采用10 ng/mLTNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h為炎癥細(xì)胞模型，進(jìn)行藥物的抗炎活性評(píng)價(jià)[14]。

綜上所述，0.01~1.00μg/mL LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，以及0.1~100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7細(xì)胞24 h均可以成功復(fù)制炎癥細(xì)胞模型。在實(shí)驗(yàn)中如何選取LPS、TNF-α、IL-1β的劑量以及刺激時(shí)間，炎癥細(xì)胞模型過重或過輕都不利于抗炎藥物的評(píng)價(jià)或篩選。應(yīng)綜合考慮，結(jié)合細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞密度，以及刺激物的純度、廠家、批次等自身實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選取。

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Comparison of LPS,TNF-α,IL-1βin Stimulating NO Secreted by RAW 264.7 Cell

YIN Jin-jin1,XINWen-yu2
1.Department of Pharmacy,Street Health Center of Xifu Town,Qingdao,Shandong Province,266106 China;2.Binzhou Medical College,Yantai,Shandong Province,264003 China

Objective To research the correlation between the LPS,TNF-α,IL-1βin stimulating NO secreted by RAW264.7 cell and time dependence and provide experimental basis for the establishment of inflammatory cell model. M ethods The LPS(0.01,0.10,1.00,10.00μg/mL),TNF-α(0.10,1.00,10.00,100.00 ng/mL)and IL-1β(0.10,1.00,10.00,100.00 ng/mL) wereused to stimulate the RAW 264.7 cell,after24h,the NO contentwasmeasured by theGreissmethod,and the LPS(1μg/mL), TNF-α(10 ng/mL)or IL-1β(10 ng/mL)were used to stimulate RAW264.7 cell for 6,12,24，48 h,and the NO contentwas measured by collecting the cell supernatant Greissmethod.Results Different doses of LPS could obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cellswithout obvious dose dependency,and different doses of TNF-αor IL-1βcould cann obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells with a certain dose dependency,and the NO secretion volume was obviously increased after LPS(1μg/mL)or TNF-α(10 ng/mL),and IL-1β(10 ng/mL)stimulation for 6~48 h could obviously induce the secretion of NOwith a certain dose dependency.Conclusion 0.01~10.00μg/mL LPSand 0.10~100.00 ng/mL TNF-αor IL-1βin stimulating the RAW264.7 cell can successfully duplicate inflammatorymodel.

Inflammation;RAW264.7 cell;LPS;TNF-α;IL-1β

R965

A

1672-5654（2017）05（b）-0003-04

2017-02-11）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.14.003

山東省博士基金資助項(xiàng)目（BS2014YY049）；煙臺(tái)市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014ZH092）；科研啟動(dòng)基金（BY2013KYQD09）。

殷津津（1985-），女，山東青島人，碩士，主管藥師，研究方向：靛紅的抗炎作用研究，七葉皂苷鈉防治術(shù)后腸粘連研究等。

辛文妤（1985-），女，山東濰坊人，博士，講師，研究方向：炎癥與疾病，E-mail:xinwenyu1391139@163.com。