程占超，馬艷軍，侯 丹，劉 俊，高 健

（國(guó)際竹藤中心 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)，北京100102）

毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析

程占超，馬艷軍，侯 丹，劉 俊，高 健

（國(guó)際竹藤中心 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)，北京100102）

以毛竹Phyllostachys edulis花為材料，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）克隆技術(shù)從毛竹中分離得到1個(gè)含完整編碼區(qū)的cDNA，長(zhǎng)603 bp，編碼200個(gè)氨基酸。命名為PheMADS15（GenBank登記號(hào)：KU721916）。對(duì)PheMADS15進(jìn)行分析表明，該基因具有典型的MADS-box基因結(jié)構(gòu)域，與擬南芥Arabidopsis thaliana的A類基因AP1編碼蛋白的同源性為58.65%。通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）克隆技術(shù)檢測(cè)了PheMADS15在毛竹花芽、苞片、穎片、稃片、漿片、雄蕊、雌蕊和幼胚中的相對(duì)表達(dá)量。分析表明：PheMADS15基因在毛竹花發(fā)育的初期表達(dá)量最高，主要在花芽中表達(dá)，可能參與毛竹成花轉(zhuǎn)變過程。圖4參20

林木育種學(xué)；毛竹；PheMADS15；MADS-box

毛竹Phyllostachys edulis作為經(jīng)濟(jì)竹種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，生產(chǎn)潛力大，在中國(guó)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。毛竹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，開花時(shí)期不確定，并且開花后集體死亡，導(dǎo)致竹林面積減少，對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境造成重大損失和破壞。近幾年竹子頻繁的開花，科研人員不斷嘗試各種試驗(yàn)手段來(lái)探究竹子開花的機(jī)制，竹子開花生物學(xué)和生殖生物學(xué)研究又成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。近年來(lái)，花器官發(fā)育研究的快速發(fā)展為竹類的花發(fā)育研究提供了借鑒和基礎(chǔ)，尤其是模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana，金魚草Antirrhinum majus，矮牽牛Petunia hybrida等開花調(diào)控基因及其功能的研究。通過對(duì)擬南芥和金魚草中同源異型突變體進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳學(xué)分析［2-4］，提出了花器官ABC模型的假說(shuō)。在植物中，A類基因能夠控制花萼形成，A類和B類基因能夠共同控制花瓣的形成，B類和C類基因共同決定雄蕊的發(fā)生和發(fā)育，而C類基因則控制植物心皮的行成。反向遺傳學(xué)研究顯示，D類基因和E類基因的同源基因同樣在調(diào)控花形態(tài)建成方面起重要作用，D類基因調(diào)控胚珠的形成和發(fā)育［5-7］，而E類基因在所有花器官的形成中起著調(diào)控作用［8-10］。在花發(fā)育調(diào)控中大部分基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，該家族基因擁有典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要在植物花器官的發(fā)育及開花時(shí)間的調(diào)控上起作用。目前，從麻竹Dendrocalamus latiflorus和綠竹Bambusa oldhamii中已經(jīng)分離了與竹子花發(fā)育密切相關(guān)的MADS-box基因，并對(duì)其功能進(jìn)行初步了分析［11-12］，但是對(duì)于毛竹MADS-box基因的相關(guān)報(bào)道比較少，研究人員曾對(duì)毛竹的E類基因PeMADS1進(jìn)行了初步的鑒定與分析［13］。本研究以毛竹花樣品為研究材料，首次克隆了1個(gè)A類的MADS-box基因PheMADS15，并對(duì)該基因與麻竹、擬南芥和水稻Oryza sativa等不同物種同源基因親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）研究它在毛竹不同組織上的表達(dá)差異，初步鑒定了PheMADS15的功能，為竹子開花和育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和主要試劑

PheMADS15基因克隆的材料為毛竹的花穗，毛竹開花實(shí)驗(yàn)地位于廣西壯族自治區(qū)桂林市，位于南嶺山系的西南部。該毛竹林屬于自然生長(zhǎng)狀態(tài)。以毛竹花器官分離出的花芽、苞片、穎片、稃片、漿片、雄蕊、雌蕊和幼胚為模板，共計(jì)8個(gè)樣品，用于克隆和組織特異性表達(dá)分析。

TA克隆T-esay Vector，Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司，柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。轉(zhuǎn)化用的感受態(tài)來(lái)自天根公司DH5α大腸埃希菌Escherichia coli。Trizol試劑購(gòu)自Life公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。SYBR Green I Master試劑盒購(gòu)自Roche公司。根據(jù)毛竹的TIP41作為內(nèi)參，用于qRT-PCR分析。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物均由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Trizol試劑盒提取毛竹花的總核糖核酸（RNA） 選取生長(zhǎng)良好的毛竹花穗，通過Trizol法提取花樣品的總RNA，用于PheMADS15基因的克隆。

1.2.2 PCR擴(kuò)增PheMADS15的全長(zhǎng)序列 根據(jù)毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的PheMADS15 cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，PheMADS15-F：5′-AGTTGAACTGAAGAGGATTGAG-3′；PheMADS15-R：5′-CTAAAGAACCCAACCAAGCATG-3′，引物由金唯智生物科技有限公司合成。以毛竹花cDNA為模板，進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系50.0 μL：5.0 μL 10.0×長(zhǎng)和精確聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LA PCR）緩沖液（加鎂離子優(yōu)化），8.0 μL三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）（2.5 mmol·L-1），5.0 μL PheMADS15-F（5.0 mmol·L-1），5.0 μL PheMADS15-R（5.0 mmol·L-1），2.0 μL模板，24.5 μL雙蒸水和0.5 μL長(zhǎng)和精確脫氧核糖核酸（LA DNA）聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；然后按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：94℃30 s，58℃30 s，72℃90 s，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，72℃10 min，16℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢驗(yàn)，回收目的DNA片段，與T-easy克隆載體連接，將PCR連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后涂含Amp的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基平板，過夜37℃培養(yǎng)，然后挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)。取1.0 μL菌液，通過引物PheMADS15-F和PheMADS15-R驗(yàn)證，PCR反應(yīng)程序同上。將檢測(cè)正確的陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序并保菌。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析 根據(jù)Trizol試劑提取毛竹花樣品的總RNA。通過NanoDrop Spectrophotometer ND-100測(cè)定提取的總核糖核酸（RNA）的濃度，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)Promega膠回收試劑盒說(shuō)明書，取1.0 μg RNA于0.2 mL離心管（EP）中，70℃孵育10 min，短暫離心后，置于冰上；準(zhǔn)備一個(gè)20.0 μL的反應(yīng)體系：4.0 μL 25 mmol·L-1氯化鎂，2.0 μL 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2.0 μL脫氧核糖核苷三磷酸混合液，0.5 μL RNA酶抑制劑，15.0×16.67 nkat鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μg多聚胸腺嘧啶T重復(fù)寡核苷酸［Oligo（dT）］15引物，1.0 μg RNA，最后添加不含核酸酶的水到20.0 μL。混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用Oligo（dT）15引物時(shí)，42℃孵育15 min，95℃，5 min，然后轉(zhuǎn)入0～5℃放置5 min。得到的cDNA用于下一步的qRT-PCR反應(yīng)的模板。其反應(yīng)體系為20.0 μL體系，包括2.0 μL的反轉(zhuǎn)錄的cDNA，10.0 μL的2×SYBR Green I Mastermix，各0.4 μL的上下游引物，加雙蒸水至反應(yīng)總體積為20.0 μL，重復(fù)3次·處理-1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR使用儀器的是Roche LightCyclerR480。

1.2.4 PheMADS15基因全長(zhǎng)序列分析 PheMADS15基因的開放讀碼框（ORF）由美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）ORF-finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）來(lái)鑒定；通過DNAMAN和MAGE 6.0軟件來(lái)分析該基因的同源性；用ExPASY（http：//web.expasy.org/compute_pi/）分析氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 毛竹花總RNA的提取

用Trizol試劑提取毛竹總核糖核酸（RNA），測(cè)得RNA樣品的光密度為1 103.0 ng·L-1。將提取到的RNA作為模板，于-20℃冰箱保存，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2 PheMADS15基因全長(zhǎng)的克隆

以毛竹花 cDNA為模板，以 PheMADS15-F和 Phe-MADS15-R為引物，PCR擴(kuò)增PheMADS15的全長(zhǎng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測(cè)，在603 bp處有一條明亮的條帶（圖1），與基因組數(shù)據(jù)的片段大小保持一致，初步判定為目的基因片段。測(cè)序的結(jié)果表明，該目的基因與毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的cDNA序列完全一致。命名為PheMADS15（GenBank登記號(hào)：KU721916）。

2.3 PheMADS15基因和編碼蛋白序列分析

用DNAMAN軟件和NCBI的Blast在線軟件分析測(cè)序結(jié)果，該基因開放閱讀框（ORF）的核酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列（圖2）。結(jié)果表明：毛竹PheMADS15基因序列含有1個(gè)603 bp的開放閱讀框，編碼200個(gè)氨基酸。用ExPASY（http：//web.expasy.org/compute_pi/）分析該基因序列編碼的蛋白。該蛋白氨基酸的相對(duì)分子量為23.48 kD，理論等電點(diǎn)為8.98。

2.4 進(jìn)化樹分析

通過MAGE 6.0運(yùn)用Neighboro-Joining方法構(gòu)建毛竹與其他物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。對(duì)PheMADS15基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖3），對(duì)比麻竹（AAR32118.1），水稻（AAF19047.1），二穗短柄草Brachypodiumdistachyon（NP_001288319.1），玉米Zea mays（ACG35179.1），小米Setaria italica（XP_004981740.1），高粱Sorghumbicolor（AAB50181.1），小麥Triticumaestivum（ABF57926.1），大麥Hordeum vulgare（AAW82994.1）和擬南芥（AT1G69120），毛竹與麻竹中的DlMADS1和水稻中OsMADS14比較近。這些MADS-box基因都與擬南芥的AP1同源。

2.5 PheMADS15組織特異性表達(dá)

提取的總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果表明，提取的毛竹花的總RNA結(jié)構(gòu)完整，光密度為1 103.0 ng·L-1，可以用于定量PCR分析。用反轉(zhuǎn)錄的毛竹花組織cDNA模板進(jìn)行qRT-PCR，以TIP41作為內(nèi)參，Phe-MADS15在毛竹8個(gè)樣品中進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)（圖4）。結(jié)果顯示：PheMADS15的表達(dá)量在花蕾中最高，其次是苞片，接著是穎片，而表達(dá)量最低是雌蕊，其次是漿片，接著是幼胚。在毛竹花發(fā)育的過程中，PheMADS15主要在花初期表達(dá)量高，隨著毛竹花的不斷發(fā)育，表達(dá)量逐漸減少。

圖1 毛竹PheMADS15基因片段電泳圖Figure 1 Electrophoresis of the amplification fragment of PheMADS15 gene of Phyllostachys edulis

圖2 PheMADS15編碼區(qū)核酸序列及其氨基酸序列Figure 2 Nucleotide and predicted amino acid sequence of PheMADS15

圖3 PheMADS15系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 3 Phylogenetic tree analysis of PheMADS15

3 討論

毛竹是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)竹種，具有非常獨(dú)特的性質(zhì)，在中國(guó)具有廣泛的栽植面積和非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，竹子造林主要以無(wú)性繁殖為主，開花無(wú)規(guī)律，花粉活性極低，雜交育種進(jìn)展緩慢，嚴(yán)重阻礙了毛竹新品種培育?，F(xiàn)代分子生物學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展，為闡明竹子開花分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有望突破常規(guī)育種的局限性，并加速育種進(jìn)程。本研究對(duì)PheMADS15基因與其他物種的同源基因構(gòu)建的進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明：毛竹與麻竹的親緣關(guān)系極為相近，其次和水稻的OsMADS14相近，而與玉米的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與之前的報(bào)道大體一致。稻亞科Ehrhartoideae和竹亞科Bambusoideae有著比較近的基因序列結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，在早期，水稻與竹類植物都同屬竹亞科［14-15］。

毛竹PheMADS15基因編碼的蛋白質(zhì)與其他物種的MADS-box有著較高的同源性，尤其是與來(lái)自麻竹的DlMADS1［16］同源性更高，表明毛竹與麻竹在進(jìn)化中可能處于比較相近的位置，進(jìn)而也證明毛竹的MADS-box基因在進(jìn)化上是相當(dāng)保守的。Phe-MADS15基因編碼蛋白序列與水稻和擬南芥A類基因同處于一個(gè)進(jìn)化樹分支中，推測(cè)該基因?yàn)锳類的功能基因。

A類功能基因在花發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在擬南芥中，AP1主要在花分生組織的初期高量表達(dá)，過表達(dá)能提前使植物開花［17-19］，在開花誘導(dǎo)中起著重要的作用。在水稻中，OsMADS14過表達(dá)導(dǎo)致水稻提前開花［20］。毛竹的PheMADS15與擬南芥的AP1以及水稻的OsMADS14在一個(gè)進(jìn)化枝上。PheMADS15在毛竹花的初期表達(dá)量比較高，尤其是在花芽中。推測(cè)PheMADS15在毛竹開花誘導(dǎo)方面可能起著重要的作用，但PheMADS15在竹子中調(diào)控開花的機(jī)制仍是未知的。以上結(jié)果為竹子開花提供了有用的信息。

圖4 PheMADS15在毛竹不同組織中特異性表達(dá)Figure 4 Relative expression of PheMADS15 in different tissues of Phyllostachys edulis

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Isolation and functional analysis of the PheMADS15 gene in Phyllostachys edulis

CHENG Zhanchao,MA Yanjun,HOU Dan,LIU Jun,GAO Jian
（Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology,International Center for Bamboo and Rattan,State Forestry Administration,Beijing 100102,China）

As a kind of transcription factors,MADS-box genes play significant roles during floral development, but their identification and functions in Phyllostachys edulis remain unclear.Here,we performed functional analysis of the PheMADS15 gene in Ph.edulis.PheMADS15 cDNA was isolated from Phyllostachys edulis by polymerase chain reaction （PCR） （GenBank accession No.KU721916）.This study also used a quantitative real-time,polymerase chain reaction （qRT-PCR）and a homology analysis.Results showed that the gene was 603 bp and encoded a protein of 200 aa,which had a typical MADS-box motif.The homology analysis showed that PheMADS15 shared 58.7%similarity with the floral meristem identity gene AP1 indicating that it belonged to A function genes.The qRT-PCR detected expression of PheMADS15 in the floral bud,glume,lemma,palea, lodicule,stamen,pistil,and young embryo.Additionally,PheMADS15 had the highest expression level in the initial-phase of flower development,especially in the floral bud formation stage.These results suggest that Phe-MADS15 might participate in regulating flower development of Ph.edulis.［Ch,4 fig.20 ref.］

forest tree breeding;Phyllostachys edulis;PheMADS15;MADS-box

S722.3

A

2095-0756（2017）03-0421-06

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2017，34（3）：421-426

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006

2016-06-14；

2016-07-31

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102607-4）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31570673）

程占超，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：chengzhan_chao@126.com。通信作者：高健，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事林木遺傳育種研究。E-mail：gaojian@icbr.ac.cn