王 徵，朱 斐

（浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

黑腹果蠅吞噬細(xì)胞對金黃葡萄球菌與大腸埃希菌的不同吞噬作用

王 徵，朱 斐

（浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

吞噬作用是一種對抗微生物病原體的重要機(jī)制，但許多細(xì)菌均有抗吞噬作用。利用透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，對黑腹果蠅 Drosophila melanogaster S2細(xì)胞吞噬熱滅活大腸埃希菌（heat inactivated Escherichia coli,HIEC）和熱滅活金黃葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus,HISA）的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：S2細(xì)胞能夠在接種后1 d內(nèi)有效清除HIEC，但不能清除HISA；經(jīng)聚肽糖（PG）或脂多糖（LPS）激活的S2細(xì)胞同樣不能有效地清除HISA，HISA能夠在S2細(xì)胞內(nèi)至少存活4 d。在接種細(xì)胞酸性指示劑（pHrodo）標(biāo)記的細(xì)菌1 h后，HIEC處于酸化環(huán)境中，而HISA沒有；檢測S2細(xì)胞的吞噬百分率顯示S2細(xì)胞吞入活細(xì)菌與滅活細(xì)菌的敏感度沒有顯著差異。 PG處理后的S2細(xì)胞防御素（defensin）與抗真菌肽（drosomycin）均顯著上調(diào)表達(dá)，但仍無法消化HISA。結(jié)果證實(shí)：滅活金黃葡萄球菌表面具有抑制吞噬作用中消化步驟的成分，而滅活大腸埃希菌沒有。研究揭示了在S2細(xì)胞對抗革蘭氏陽性菌時(shí)，吞噬作用在清除該類病原體時(shí)所起到的重要作用以及金黃葡萄球菌抑制消化過程從而抵御細(xì)胞吞噬的策略。圖7表1參38

免疫生物學(xué)；吞噬作用；黑腹果蠅；金黃葡萄球菌；大腸埃希菌；防御素；抗真菌肽

無論是脊椎動(dòng)物還是無脊椎動(dòng)物，先天性免疫都是第一線防御機(jī)制，對抗著各類病原體的侵染。吞噬作用作為一種高度保守進(jìn)程的先天性免疫機(jī)制，能夠?yàn)樵S多細(xì)胞用來消化微生物病原體以及凋亡或壞死的細(xì)胞殘?。?-3］。在吞噬作用中，外來物質(zhì)被細(xì)胞識別并結(jié)合到細(xì)胞表面，被吞噬小體吞入，并在被吞入的物質(zhì)周圍形成細(xì)胞器［4］。吞噬小體經(jīng)過裂變以及與核內(nèi)體、溶酶體，或是兩者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶體。進(jìn)入吞噬溶酶體內(nèi)部的病原體則被低pH值、水解作用以及自由基所消滅［5］。黑腹果蠅Drosophila melanogaster是最常見的果蠅，因擁有與哺乳動(dòng)物相近的先天性免疫系統(tǒng)，而被認(rèn)為是研究宿主與微生物相互作用的最佳基因模式生物［6-7］。近年來，果蠅Schneider細(xì)胞株（S2）細(xì)胞已被確認(rèn)是一種非常適合研究細(xì)胞感染的宿主模型，在對抗衣原體Chlamydia，單胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克體Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大腸埃希菌Escherichia coli以及金黃葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌［6,8-14］的體外感染過程中，S2細(xì)胞與哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制非常相近。金黃葡萄球菌是一種主要的人類病原體，致病率顯著，研究顯示金黃葡萄球菌可能是一種兼性胞內(nèi)病原體［15］，并認(rèn)為金黃葡萄球菌可以在巨噬細(xì)胞中存活數(shù)日而不影響細(xì)胞的生存情況［16］。筆者就果蠅S2細(xì)胞對熱滅活大腸埃希菌（heat inactivated Esherichia coli,HIEC）及熱滅活金黃葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus,HISA）的吞噬模式展開研究，揭示了在S2細(xì)胞對抗革蘭氏陽性菌時(shí)，吞噬作用在清除該類病原體時(shí)所起到的重要作用以及金黃葡萄球菌抑制消化過程從而抵御細(xì)胞吞噬的策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑腹果蠅S2細(xì)胞株從初代培養(yǎng)24 h的胚胎中分離獲得，在體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清的果蠅培養(yǎng)基（Ivitrogen,美國）中28℃培養(yǎng)［17］。為了確認(rèn)脂多糖（LPS，Sigma，美國）或聚肽糖（PG，Sigma，美國）的活化作用是否會增強(qiáng)吞噬作用，將S2細(xì)胞以106個(gè)·孔-1鋪開在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG經(jīng)超聲處理1 h后，按1.0 mg·L-1的劑量加入到每個(gè)孔中孵育1 h，備用。

大腸埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培養(yǎng)基（LB）37℃培養(yǎng)24 h后，10 000 g離心10 min收集細(xì)菌。金黃葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化鈉的哥倫比亞培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，在鹽溶液中重懸。熱滅活大腸埃希菌（HIEC）或熱滅活金黃葡萄球菌（HISA）以5×109個(gè)·L-1的密度接種于S2細(xì)胞，28℃孵育1 h。不同時(shí)間段收集S2細(xì)胞分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備與透射電子顯微鏡（TEM）分析 收集感染后的果蠅S2細(xì)胞（5.0～10.0 μL），在含體積分?jǐn)?shù)2%多聚甲醛與2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液（pH 7.4）固定劑中浸泡16 h，室溫下不斷旋轉(zhuǎn)。以0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液清洗，3次·樣品-1，5 min·次-1，保持室溫下旋轉(zhuǎn)。隨后加入體積分?jǐn)?shù)2%鋨（Osmium），并以0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液清洗3次，5 min·次-1，保持室溫下旋轉(zhuǎn)。樣品固定，20.0 g·L-1醋酸雙氧鈾緩沖液（pH 5.2）進(jìn)行染色，室溫避光染色1 h，保持旋轉(zhuǎn)，隨后以0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液清洗3次，5 min·次-1并不斷旋轉(zhuǎn)。通過逐級增加的丙酮溶液（體積分?jǐn)?shù)依次為50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）對樣品進(jìn)行脫水，室溫下旋轉(zhuǎn)處理，隨后在100%環(huán)氧丙烯中毒處理10 min。以EMBED 812或502樹脂黏結(jié)劑進(jìn)行最終的滲透處理，V（環(huán)氧丙烯）∶V（黏合劑）=1∶1，室溫旋轉(zhuǎn)處理10 min；V（環(huán)氧丙烯）∶V（黏合劑）=1∶2，室溫旋轉(zhuǎn)處理20 min；100%黏合劑處理10 min。最終，樣品中加入新的100%黏合劑，滲透16 h后，在干燥烘箱中以60℃聚合 24～48 h。Hitachi 7650透射電鏡（Hitachi,日本）在70 kV下采集圖像［10］。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡分析 果蠅S2細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）的施耐德培養(yǎng)基12孔板中鋪板培養(yǎng)，并將密度為 5×109個(gè)·L-1異硫氰酸熒光素標(biāo)記（FITC，Invitrogen,美國）的熱滅活大腸埃希菌（HIEC）/熱滅活金黃葡萄球菌（HISA），加入到S2細(xì)胞中 28℃共培養(yǎng)1 h。以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，將混合細(xì)胞移植到多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片（Sigma，美國）上固定。之后，分別使用羅丹明鬼筆環(huán)肽（Invitrogen,美國）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美國）一同孵育，用以標(biāo)記肌動(dòng)蛋白或細(xì)胞核DNA［18］。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測分析 細(xì)胞培養(yǎng)與處理見1.2.2節(jié)。果蠅S2細(xì)胞接種細(xì)菌后，以PBS清洗，將混合細(xì)胞收集到流式管中，通過流式細(xì)胞儀檢測S2細(xì)胞內(nèi)的FITC熒光信號，統(tǒng)計(jì)S2細(xì)胞對HIEC和HISA的吞噬能力。為了研究細(xì)胞的吞噬作用對活細(xì)菌和熱滅活細(xì)菌的敏感度，以胞內(nèi)有1個(gè)以上FITC標(biāo)記細(xì)菌的細(xì)胞在所有細(xì)胞中所占的百分比為參考值來予以評價(jià)。

1.2.4 細(xì)胞酸性指示劑（pHrodo）標(biāo)簽檢測溶酶體酸化 在果蠅S2細(xì)胞（培養(yǎng)方法見1.2.2節(jié)）中加入LPS或PG，孵育S2細(xì)胞1 h，從而激活S2細(xì)胞；激活后的S2細(xì)胞以1×109個(gè)·L-1在6孔板中鋪開，分別接種pHrodo標(biāo)記的滅活病原菌（5×109個(gè)·L-1），28℃共孵育1 h。收集混合細(xì)胞，立刻在共聚焦顯微鏡下觀察。分別統(tǒng)計(jì)不同處理組中，吞入pHrodo標(biāo)記病原菌的S2細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占百分比［18］。不同處理組間的差異以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為顯著。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 果蠅S2細(xì)胞經(jīng)過不同實(shí)驗(yàn)處理后，以PBS清洗，收集細(xì)胞，使用Trizol試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA，操作步驟依據(jù)產(chǎn)品使用說明書［18］。即刻使用5.0 μg總核糖核酸，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Takara，日本）合成為20.0 μL cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量的檢測采用基因特異引物與TaqMan探針（表1），反應(yīng)體系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA樣品，7.2 μL無酶水，各基因?qū)?yīng)TaqMan探針0.3 μL，以及各特異性引物0.4 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）程序如下：95℃，30 s；90℃，5 s，60℃，30 s，循環(huán)50次。數(shù)據(jù)分析使用iQTM5軟件。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究中每組試驗(yàn)均使用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析使用t檢驗(yàn)，判斷對照組與實(shí)驗(yàn)組的差異性，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中引物與TaqMan探針序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 透射電鏡觀察黑腹果蠅S2細(xì)胞對HIEC或HISA的吞噬作用

透射電鏡下觀察黑腹果蠅S2細(xì)胞對滅活大腸桿菌（HIEC）或滅活金黃葡萄球菌（HISA）的吞噬過程，發(fā)現(xiàn)孵育1 h后S2細(xì)胞即可順利吞噬HIEC（圖1A），孵育后第1天S2細(xì)胞內(nèi)HIEC已消失（圖1B）；但共孵育1 h后S2細(xì)胞未能吞噬HISA（圖1C），HISA（圖2A）與S2細(xì)胞共孵育4 d，仍保持形態(tài)完整（圖1D，圖2B，圖2C，圖2D，圖2 E）。在PG或LPS激活后，S2細(xì)胞也不能有效地吞噬HISA（圖2F，圖2G，圖2H）。與健康的S2細(xì)胞相比，在接種后第4天，S2細(xì)胞吞入的HISA依然形態(tài)完整（圖2E，圖2F，圖2G，圖2H）；吞入HISA的S2細(xì)胞沒有出現(xiàn)凋亡或破裂，表明細(xì)胞內(nèi)的HISA并沒有對 S2細(xì)胞造成明顯的損傷。

圖1 透射電鏡觀察黑腹果蠅S2細(xì)胞對HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells

圖2 透射電鏡觀察黑腹果蠅S2細(xì)胞對HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells

2.2 激光共聚焦顯微觀察黑腹果蠅S2細(xì)胞對HIEC或HISA的吞噬作用

激光共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在S2細(xì)胞吞噬熱滅活大腸桿菌HIEC 1 h后，胞內(nèi)可觀察到HIEC發(fā)出的綠色熒光（圖3A）；吞噬發(fā)生1 d后， S2細(xì)胞內(nèi)觀察不到綠色熒光粒子（圖3B）；表明HIEC已經(jīng)被S2細(xì)胞清除。同樣處理下，熱滅活金黃葡萄球菌HISA沒有被S2細(xì)胞清除。由圖3C和圖3D可知，HISA被吞噬后，被S2細(xì)胞內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)存在。由此可知，在S2細(xì)胞接種滅活菌后，HIEC與HISA均被S2細(xì)胞吞入，但HIEC被S2細(xì)胞清除，而HISA則沒有被清除。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測S2細(xì)胞對HIEC或HISA的吞噬作用

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察黑腹果蠅S2細(xì)胞對FITC標(biāo)記的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells

流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果由圖4可知：接種1 h后，吞入了至少1個(gè)HIEC粒子的S2細(xì)胞在所有S2細(xì)胞中所占的比例接近40%，與S2細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的結(jié)果相近；吞入至少1個(gè)HISA粒子的S2細(xì)胞在所有S2細(xì)胞中所占的比例接近25%，與S2細(xì)胞吞噬金黃葡萄球菌的結(jié)果相近。說明S2細(xì)胞吞入活細(xì)菌和熱滅活細(xì)菌的敏感度并沒有顯著差異。

2.4 吞噬溶酶體酸化觀察和吞噬率檢測結(jié)果

細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境可誘導(dǎo)pHrodo標(biāo)記的病原菌激發(fā)出紅色熒光，從而指示吞噬溶酶體的形成。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種HIEC 1 h后，S2細(xì)胞內(nèi)可觀察到紅色熒光，表明S2細(xì)胞對HIEC的消化程序被激活，細(xì)胞內(nèi)形成了酸性環(huán)境（圖5A）；圖5B中未能觀察到紅色熒光，表明HISA未能激活S2細(xì)胞的酸化過程。使用LPS或PG激活S2細(xì)胞，再進(jìn)行接種觀察，可發(fā)現(xiàn)在接種HISA 1 h后，未能觀察到紅色熒光，說明S2細(xì)胞的酸化過程仍未被激活。

為揭示LPS或PG的刺激對S2細(xì)胞吞噬活性的影響，用共聚焦顯微鏡觀察S2細(xì)胞吞噬pHrodo標(biāo)記菌并統(tǒng)計(jì)吞噬率。結(jié)果表明：共孵育1 h后，只有接種HIEC的S2細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)酸性環(huán)境，其他的處理均不能誘導(dǎo)S2細(xì)胞酸化（圖6）。檢測吞噬百分比發(fā)現(xiàn)，只有HIEC處理組的吞噬率顯著高于對照組（P＜0.01）。使用LPS或PG激活S2細(xì)胞后再接種，S2細(xì)胞對HISA的吞噬率仍沒有顯著增加。這表明溶酶體酸化過程只發(fā)生在S2細(xì)胞吞噬HIEC的過程中，而LPS或PG刺激并不能誘導(dǎo)S2細(xì)胞吞噬HISA后的酸化過程（圖6）。

圖4 孵育1 h后黑腹果蠅S2細(xì)胞對FITC標(biāo)記的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation

圖5 激光共聚焦顯微觀察孵育1 h后黑腹果蠅S2細(xì)胞對pHrodo標(biāo)記的HIEC及HISA的吞噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基因表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中引物與TaqMan探針序列如表1所示。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同處理?xiàng)l件下S2細(xì)胞內(nèi)的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：防御素的表達(dá)量在HISA，HISA＋LPS和HISA＋PG等3個(gè)處理組中，均發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.01）；抗真菌肽的表達(dá)量僅在HISA＋PG處理組中發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖7）；Relish的表達(dá)量在HIEC處理組中發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.01），但在HISA處理組中無顯著變化。

3 討論與結(jié)論

吞噬作用是動(dòng)物對抗微生物病原體的一種重要免疫防御機(jī)制，由吞噬細(xì)胞來執(zhí)行具體的功能［19-20］。本研究對黑腹果蠅S2細(xì)胞吞噬熱滅活大腸埃希菌（HIEC）和金黃葡萄球菌（HISA）的異同進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：S2細(xì)胞能夠在接種后1 d有效吞噬并清除HIEC，但卻無法清除HISA；即使到了接種后4 d，S2細(xì)胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)PG或LPS誘導(dǎo)激活的S2細(xì)胞同樣不能有效地清除HISA。與健康的S2細(xì)胞相比，存在于細(xì)胞內(nèi)的HISA在接種4 d后并沒有明顯破壞S2細(xì)胞。許多研究證明在細(xì)胞培養(yǎng)模式下，金黃葡萄球菌能夠逃逸宿主細(xì)胞的免疫系統(tǒng)，具有隱藏的潛能［21］，可在胞內(nèi)堅(jiān)持存活一段時(shí)間［22-23］。在本研究中，熱滅活金黃葡萄球菌存在于S2細(xì)胞中達(dá)4 d以上，說明滅活后的金黃葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，這與金黃葡萄球菌存在多個(gè)抗吞噬因子有關(guān)［24-26］。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞吞噬率發(fā)現(xiàn)，熱滅活并不會影響吞噬作用對滅活細(xì)菌的敏感性，這一點(diǎn)已被另一項(xiàng)研究所證實(shí)［11］。

圖6 共孵育1 h后S2細(xì)胞對pHrodo標(biāo)記的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA

圖7 黑腹果蠅S2細(xì)胞吞噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表達(dá)譜Figure 7 Expression profiles of drosomycin,defensin and relish in phagocytosis of HISA

在消化進(jìn)程中，吞噬溶酶體的pH值降低，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化，可幫助吞噬作用的進(jìn)行，并能夠通過pHrodo染料的使用進(jìn)行檢測［27］。LPS是革蘭氏陰性菌的主要的細(xì)胞膜成分，可以通過Imd（immune deficiency）免疫信號通路激活巨噬細(xì)胞；PG是革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁上的主要成分，可以通過Toll信號通路激活巨噬細(xì)胞。使用LPS或PG刺激接種HISA的S2細(xì)胞，細(xì)胞并未形成酸化環(huán)境。通過透射電鏡與激光共聚焦顯微鏡的觀察，明確了即使S2細(xì)胞經(jīng)過LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的結(jié)果；檢測S2細(xì)胞對pHrodo標(biāo)記的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶體的酸化只發(fā)生在S2細(xì)胞對HIEC的吞噬過程中，其他處理并不能引起S2細(xì)胞的酸化。

黑腹果蠅S2細(xì)胞的吞噬作用中包括了Toll與Imd等2條信號通路，其中Toll通路參與到抗革蘭氏陽性菌的免疫作用中，該免疫應(yīng)答機(jī)制中包含Defensin基因［28-29］的表達(dá)，而已知的防御素（defensin）是一類由小胱甘酸富集而成，可被誘導(dǎo)的抗微生物肽，有利于宿主對真菌的防御應(yīng)答［30］；Drosomycin基因表達(dá)的Drosomycin是一類可誘導(dǎo)的抗真菌肽，同樣由Toll通路調(diào)節(jié)，并在全身脂肪體中均有表達(dá)［31-32］。觀察發(fā)現(xiàn)防御素的表達(dá)量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG處理中，均發(fā)生顯著上調(diào)；抗真菌肽的表達(dá)量在HISA+PG處理中顯著上調(diào)；由此可以推斷，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG雖然能激活S2細(xì)胞的Toll通路，但卻無法有效清除HISA，同樣，胞內(nèi)的HISA也不會誘導(dǎo)S2細(xì)胞凋亡。由此可知，金黃葡萄球菌作為一種人類病原體，對黑腹果蠅來說也是高致病的病原，與其他革蘭氏陽性菌相比，它表現(xiàn)出了更強(qiáng)的對防御素的抵御能力［36］。在黑腹果蠅中，Imd通路調(diào)節(jié)著對革蘭氏陰性菌的免疫應(yīng)答，Relish作為NF-κB通路的轉(zhuǎn)錄因子，是Imd通路的終極目標(biāo)［28］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Relish在HIEC處理中顯著上調(diào)（P＜0.01）， 說明Imd通路在HIEC處理中被激活，而激活的Imd通路最終誘導(dǎo)S2細(xì)胞吞噬HIEC，說明Relish的表達(dá)量與S2細(xì)胞吞噬HIEC的百分率呈正相關(guān)。

有研究表明：金黃葡萄球菌能夠迅速地逃避溶酶體/吞噬體的捕獲，在細(xì)胞液泡內(nèi)存活可長達(dá)4 d，之后逃入細(xì)胞質(zhì)中［16,37-38］。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)滅活金黃葡萄球菌同樣能夠在S2細(xì)胞內(nèi)存活4 d，其細(xì)胞表面物質(zhì)具有抗吞噬消化的活性。該結(jié)果同時(shí)暗示著無脊椎動(dòng)物吞噬細(xì)胞對清除部分革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌均有所幫助，但細(xì)胞免疫對這些胞內(nèi)細(xì)菌的清除效力勝于體液免疫。

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Differential phagocytosis of Staphylococcus aureus and Escherichia coli by Drosophila melanogaster S2 phagocytes

WANG Zhi,ZHU Fei
（College of Animal Science and Technology,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Phagocytosis is an important defense mechanism against microbial pathogens,but many pathogens get the ability to subvert it.This research was aimed at discovering the potential mechanism of the gram positive and negative bacteria to survive from phagocytosis.In this study,Drosophila melanogaster S2 cells were applied as the host,and active/heat-inactivated Escherichia coli and Staphylococcus aureus were applied as invaders.Cultured S2 cells were incubated with Escherichia coli（EC）,Staphylococcus aureus（SA）,heat-inactivated Escherichia coli（HIEC）or Staphylococcus aureus （HISA）,separately.After incubation,S2 cells were collected for transmission electron microscopy （TEM）analysis,confocal laser scanning microscopy analysis, flow cytometry （FCM）analysis and real time quantitative PCR analysis.Results showed that S2 cells could phagocytose HIEC efficiently at 1 d post-inoculation,but they could not clear HISA.HISA could survive within S2 cells for at least 4 d,and peptidoglycan （PG）and lipopolysaccharide-activated S2 cells could not digest HISA efficiently either.Comparing S2 cells,intracellular HISA did not destroy the S2 cells even at 4 d postinoculation.The pHrodo-labeled HIEC was observed in an acidified environment at 1 h post-inoculation,but HISA was not.In addition,the percentage of phagocytized pHrodo-labeled bacteria showed no great differenceswhether the bacteria were engulfed alive or heat-killed.Defensin and drosomycin were up-regulated in the HISA+PG treatment,but S2 cells could not digest HISA.Also,results confirmed that antiphagocytic properties were located on the surface of heat-inactivated S.aureus but not on that of heat-inactivated E.coli.Thus, cellular immunity is important for Drosophila melanogaster S2 cells fighting gram-positive bacteria,and the role of phagocytosis shed light on clearing of the bacterial pathogens.［Ch,7 fig.1 tab.38 ref.］

immunobiology;phagocytosis;Drosophila melanogaster;Staphylococcus aureus;Escherichia coli; defensin;drosomycin

S856；R392

A

2095-0756（2017）03-0381-08

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2017，34（3）：381-388

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.001

2016-04-18；

2016-07-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31370050）

王徵，從事甲殼動(dòng)物抗病免疫研究。E-mail：jiu.jingli@qq.com。通信作者：朱斐，副研究員，博士，從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫與疾病研究。E-mail：zhufei@zju.edu.cn