柴曉娟，郭瑋龍，陳 慧，王俊榮，謝德志，金水虎

（1.浙江農林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 臨安 311300；2.浙江省嵊州市農林局，浙江 嵊州312400）

藺草種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

柴曉娟1，郭瑋龍2，陳 慧1，王俊榮1，謝德志1，金水虎1

（1.浙江農林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 臨安 311300；2.浙江省嵊州市農林局，浙江 嵊州312400）

為研究藺草Juncus effusus種質資源遺傳多樣性，采用簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（inter-simple sequence repeats，ISSR）分子標記技術對來自不同區(qū)域的36份藺草種質資源進行遺傳多樣性分析，并探討它們的親緣關系。結果顯示：72對ISSR引物中共篩選出23對引物能擴增出穩(wěn)定清晰條帶；36份藺草種質的基因組DNA共擴增出148條帶，其中130條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達87.84%。應用NTSYSpc 2.1軟件分析顯示，36份藺草種質材料間的遺傳相似系數(shù)（genetic similarity,GS）為0.405 6～0.944 1，表明藺草種質資源具有豐富的遺傳多樣性。非加權組平均法（unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA）聚類顯示，在遺傳相似系數(shù)0.650 3處可將36份藺草種質劃分為5大類群，第Ⅰ大類群可分為3個亞類，大多數(shù)來自于相同或相近地理區(qū)域的材料聚于同一類或亞類，野生種質與栽培種質有分別聚在一起的趨勢。研究結果從分子水平揭示了藺草種質資源的主要遺傳多態(tài)性特點，為今后藺草育種及雜交親本的選擇提供理論依據(jù)。圖2表2參26

植物學；藺草；種質資源；ISSR標記；遺傳多樣性

藺草Juncus effusus俗稱席草，屬燈心草科Juncaceae多年生宿根草本，是一種重要的經(jīng)濟作物［1］。除了干旱和高海拔地區(qū)外，北美洲、歐洲及亞洲等亞熱帶地區(qū)均有分布，中國、日本、韓國及東南亞一些國家均有栽培。藺草制品具有調節(jié)干濕的功能，夏季能保持適度的干燥，使人的皮膚觸感異常舒適，因此，藺草多用于編制榻榻米、草席、草帽、草墊等生活日用品。此外，藺草還有一定的生態(tài)價值和藥用價值［2］。中國是世界上利用和栽培藺草最早的國家之一，但近年來由于藺草品種混雜非常嚴重，極大地影響和限制了藺草的生產(chǎn)。目前，有關藺草的研究主要集中在生物學特性、生理生化、繁殖栽培技術等方面［3-6］，有關藺草種質資源遺傳多樣性的研究還未見報道。本研究利用簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）分子標記技術［7-12］對36份藺草種質進行遺傳多樣性分析，以揭示藺草種質資源的主要遺傳多態(tài)性特點，確定藺草種質資源的親緣關系，為藺草新品種的選育和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

36份藺草種質來自美國和中國（浙江、西藏、四川）等不同地區(qū)，其中包括22份主要栽培資源和14份野生資源。2013年收集后，栽培于浙江農林大學試驗基地。材料來源及采集地見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及定量 采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法，從新鮮的藺草嫩莖中提取基因組DNA。取新萌生的藺草嫩莖約0.5 g在液氮冷凍下研磨成粉末，迅速轉入2.5 mL離心管，加入800.0 μL預熱的2×CTAB提取緩沖液［質量分數(shù)為2%CTAB，三羥甲基氨基甲烷與鹽酸緩沖液（Tris-HCl）100.0 mmol·L-1，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）25.0 mmol·L-1，氯化鈉1.5 mol·L-1，體積分數(shù)為1%巰基乙醇］，充分混勻后置于65℃水浴45 min，隔10 min輕搖1次，使樣品充分懸浮在提取緩沖液中；取出離心管，4℃，12 000 r·min-1，離心10～15 min；取上清，加入等體積的V（氯仿）∶V（異戊醇）=24∶1混合液，輕柔顛倒混勻，4℃，使乳化10 min，取出離心管，4℃，12 000 r·min-1，離心10～15 min；重復上一步；取上清，加入等體積-20℃預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于4℃沉淀30 min；4℃，6 000 r· min-1離心8 min，棄上清，用體積分數(shù)為70%的乙醇洗滌沉淀2～3次，風干，加入100.0 μL TE（10.0 mmol·L-1Tris-HCl，1.0 mmol·L-1EDTA）溶解，加入1.0 μL 10.0 mg·L-1的RNA降解酶（RnaseA），4℃保存。用質量分數(shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用蛋白核酸分析儀根據(jù)D（260）/D（280）的比值判斷其純度。用無菌水稀釋到均一質量濃度50.0 mg·L-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 材料來源及采集地Table 1 Sources of experiment materials

1.2.2 ISSR引物的篩選 隨機選取2份藺草種質的DNA，利用加拿大哥倫比亞大學公布的在禾本科Gramineae植物中常用的ISSR引物 （UBC801-UBC900）72對 （引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）進行篩選，篩選出23對擴增條帶較穩(wěn)定、清晰的引物（表2），用于全部藺草種質資源擴增。

1.2.3 簡單序列重復-聚合酶鏈式反應（ISSR-PCR）體系的構建 根據(jù)小麥Triticum eastivum［7］，水稻O-ryza sativa［13］，冰草屬 Agropyron［14］，早熟禾 Poa［15］和中型狼尾草 Pennisetum longissimum var.intermedium［16］等的方法設置ISSR-PCR反應體系和擴增程序。通過預試驗，建立藺草ISSR分析的優(yōu)化反應體系及反應程序。反應體系總體積20.0 μL，包含1.0 μL DNA模板（50 mg·L-1），14.5 μL雙蒸水，1.3 μL鎂離子（25 mmol·L-1），2.0 μL緩沖液（10×），1.5 μL脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol·L-1），0.2 μL Taq酶（5×16.67 nkat），0.5 μL引物（10.0 μmol·L-1）。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃預變性3 min，94℃變性1 min，退火45 s（根據(jù)引物的退火溫度Tm所得），72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸7 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用含0.5 mg·L-1溴化乙錠（ethidium bromide，EB）質量分數(shù)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，1×三羥甲基氨基甲烷-硼酸（TBE）緩沖液，120 V電壓下電泳40 min。以100 bp DNA梯度為標準分子量標記，電泳結果在紫外凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 根據(jù)在凝膠同一遷移位置上DNA條帶有無進行統(tǒng)計，有條帶 （顯性）記為“1”，無條帶（隱性）或模糊不清記為 “0”，形成0/1矩陣。多態(tài)性比例（%）=（總譜帶數(shù)-共有帶數(shù)）/總譜帶數(shù)×100%。用NTSYSpc 2.1軟件進行遺傳相似系數(shù)計算，利用非加權組平均法（UPGMA）構建聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增結果及多態(tài)性分析

利用篩選出的23對ISSR引物對供試材料進行PCR擴增，共擴增出148條穩(wěn)定清晰的DNA條帶（表2），每對引物擴增帶數(shù)為4～10條，平均每對引物擴增條帶數(shù)為6.43條；所有引物中，引物UBC815和引物UBC895擴增帶數(shù)最多，均為10條，引物UBC859和引物UBC875的引物擴增帶數(shù)最少，均為4條；在所有供試材料中具有多態(tài)性的引物共15對，擴增出多態(tài)性條帶130條，多態(tài)性條帶比率為87.84%，平均每對引物擴增出多態(tài)性條帶5.65條。

2.2 遺傳相似性分析

36份藺草種質間的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.405 6～0.944 1（圖2），具有豐富的遺傳多樣性。其中，DY-02和DY-03之間的遺傳相似系數(shù)最大，達0.944 1，表明其親緣關系較近；遺傳相似系數(shù)最小的是YF-01與LZ之間，為0.405 6，表明其親緣關系較遠。36份藺草種質材料中，大多數(shù)來自于相同或相近地理位置的材料間相似系數(shù)值較大，說明其親緣關系較近。

圖1 引物UBC 863和引物UBC 846的擴增圖譜Figure 1 ISSR amplification of Juncus effusus with primer UBC863 and UBC846

表2 引物序列及其擴增產(chǎn)物的多態(tài)性Table 2 Sequence and amplified loci polymorphism of 23 primers

2.3 UPGMA聚類分析

為使供試藺草種質間的親緣關系更加清晰明確，采用UPGMA法對得到的遺傳相似系數(shù)進行聚類分析，結果如圖2所示。在遺傳相似系數(shù)為0.650 3處，將36份藺草種質資源分為5大類群：第Ⅰ大類中有29份材料，又可分為3個亞類：第一亞類包括YD-01，YD-02，XY-04，XY-07，YZ-01，HB-01，HB-02，HR-02，HB-03，HR-01，XM-01，LH，SC，XY-02，XY-01，XY-03，YZ-02；第二亞類包括BC，ZJ，DY-04，HGL，SM-01，SM-02，DY-02，DY-03，NH，XS，WZ；第三亞類僅有DY-01；第Ⅱ大類包括HZ，JH；第Ⅲ大類僅有YF-01；第Ⅳ大類包括LS，SZ和MG；第Ⅴ大類包括LZ。從供試材料的地理來源來看，第一亞類中除LH和SC這2份種質外，其余15份均來自鄞州。第二亞類除BC，HGL，DY-02和DY-03外，其余7份均為野生藺草種質資源。第Ⅱ大類為2份野生種質，第Ⅳ大類中LS和SZ等2個國內野生種質首先聚在一起，然后再與國外MG野生種質聚為一起。結果表明：材料地理來源對系統(tǒng)聚類結果影響較大，大部分來自于同一地區(qū)的材料聚為一類，少部分材料在聚類圖中無一定規(guī)律；野生種質與栽培種質有分別聚在一起的趨勢。

3 討論與結論

3.1 ISSR標記在藺草種質中的鑒別能力

ISSR標記技術具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強、成本低廉及操作簡單等優(yōu)點，廣泛應用于植物群體遺傳多樣性分析和種質資源鑒定等研究［17］。李君禮等［18］利用簡單序列重復（SSR）引物對4個藺草代表性品種進行PCR擴增，結果表明：67對SSR引物在4個品種中均有擴增條帶，但與水稻相比，具有差異的SSR標記卻很少，原因可能與藺草特有的基因組有關。ISSR標記在種內不同種質資源或不同品種間具有較好的鑒別能力［17］。本研究利用ISSR引物對藺草不同種質資源進行遺傳多樣性分析，從72對ISSR引物中篩選出23對有效引物（占31.94%）對36份藺草種質DNA進行PCR擴增，共擴增出148條帶，其中具有多態(tài)性的引物15對，共擴增出多態(tài)性條帶130條，多態(tài)性條帶比率為87.84%，不同引物間擴增出4～8條多態(tài)性條帶，不同種質資源間的相似系數(shù)變化范圍為0.405 6～0.944 1，說明藺草種質資源具有豐富的遺傳多樣性，同時也證明ISSR引物可在同一種群內不同種質資源間進行鑒別。曾亮等［14］對冰草屬植物研究發(fā)現(xiàn)，11條有效引物（占11.80%）共檢測到84個擴增位點，多態(tài)性位點比率為70.2%，品種間遺傳相似系數(shù)為0.083 0～0.706 0，表現(xiàn)出較高的遺傳多態(tài)性。劉歡等［19］研究發(fā)現(xiàn)，8個ISSR有效引物（占16.67%）共擴增出多態(tài)性帶144條，86.10%擴增片段能夠揭示材料間的遺傳差異，48個燕麥Avena品種間相似系數(shù)為0.583 3～0.941 7，具有豐富的遺傳基礎。此外，在中型狼尾草種質［16］、黑麥屬Secale植物［20］、芒荻類Miscanthus&Triarrhena植物［21］和蘆葦Phragmites australis［22］研究中均發(fā)現(xiàn)ISSR引物具有較高的鑒別能力。AL-TURKI等［13］對水稻研究發(fā)現(xiàn)，11條ISSR引物平均多態(tài)性比例超過75%。JOSHI等也發(fā)現(xiàn)30個ISSR引物中有60%的引物能產(chǎn)生清晰擴增產(chǎn)物。在小麥中，NAGAOKA等發(fā)現(xiàn)100條引物中33條能產(chǎn)生清晰的擴增產(chǎn)物。以上研究材料均屬于單子葉植物，將試驗結果與本研究結果相比較，藺草ISSR引物的有效數(shù)目低于水稻和小麥，但高于冰草屬、燕麥品種、中型狼尾草和黑麥屬植物。從多態(tài)性條帶比率來看，藺草的多態(tài)性條帶比率明顯高于冰草、黑麥屬植物和水稻，與燕麥和中型狼尾草相差不大，低于芒荻類植物和蘆葦。從遺傳相似系數(shù)來看，藺草的遺傳相似系數(shù)與燕麥和黑麥屬植物大致相同，略低于中型狼尾草，說明藺草種質具有廣泛的遺傳基礎，遺傳多樣性豐富。這為了解藺草的遺傳背景、種質資源的開發(fā)利用、新品種培育和生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

圖2 36份藺草種質基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類圖Figure 2 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 36 accessions

3.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的基本組成部分，一般是指種內不同種群間或是一個種群內的不同個體的遺傳變異總和［23］。一個物種遺傳多樣性越高，適應能力越強，越有利于擴展新環(huán)境和擴大分布范圍［24］。遺傳距離是物種居群間遺傳相似性的反映，用來揭示群體的遺傳結構。李軍等［25］研究認為：遺傳距離與空間距離之間并無明顯的內在關系，自然選擇、基因突變及基因流是導致遺傳變異的主要因素。另一些研究認為，植物群體間的地理隔離與遺傳關系存在著正相關性，即地理距離越大，則遺傳距離越大［26］。李紹臣等［23］對黃檗Phellodendron amurense種群研究發(fā)現(xiàn)，地理種群近的能很好的聚在一起。本研究結果表明：藺草種質資源間具有相對較寬的遺傳基礎，存在較大的遺傳變異性，其原因可能是在遺傳進化和育種過程中其基因組DNA發(fā)生豐富的變異，從而構成豐富的藺草資源基因庫。從聚類的結果來看，大多數(shù)來自于相同或相近地理區(qū)域的材料可以聚于同一類或亞類，材料間呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律，這與冰草屬［14］和燕麥種質［20］研究聚類結果一致，其原因可能是長期自然選擇使群體基因型趨于相似的結果；野生種質與栽培種質有分別聚在一起的趨勢；聚類中來自鄞州栽培種質YF-01單獨聚為一大類，可能是由于在長期的進化過程中有個別基因發(fā)生了突變；此外，少部分材料在聚類圖中不遵循一定的規(guī)律，其原因可能是不同地區(qū)之間的相互引種導致種質的聚類結果與種質地理來源沒有直接聯(lián)系。

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Genetic diversity of Juncus effusus germplasm by ISSR markers

CHAI Xiaojuan1,GUO Weilong2,CHEN Hui1,WANG Junrong1,XIE Dezhi1,JIN Shuihu1
（1.School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Agriculture and Forestry Bureau of Shengzhou City,Shengzhou 312400,Zhejiang,China）

To study the genetic diversity of Juncus effusus resources,the genetic diversity of 36 J.effusus germplasm resources from both home and abroad were analyzed by Inter Simple Sequence Repeats（ISSR）markers.Analysis included an Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean（UPGMA）cluster analysis.Results showed 23 primers with clear polymorphic bands selected from 72 primers.A total of 148 bands,of which 130 were polymorphic,were amplified from the 36 materials with the proportion of polymorphic loci being 87.84%.The genetic similarity coefficient for varieties was between 0.405 6 and 0.944 1,which showed rich genetic diversity.The UPGMA cluster analysis produced a genetic similarity coefficient of 0.650 3 for the boundaries with the 36 materials divided into five groups and the first group being divided into three subgroups.Results were connected to region and cultivar origin with materials from the same region mostly classified into the same group or subgroup.This research revealed the genetic diversity of J.effusus germplasm resources at the molecular level for the first time which could provide a theoretical basis for breeding.［Ch,2 fig.2 tab.26 ref.］

botany;Juncus effusus;germplasm resources;ISSR markers;genetic diversity

S718.46

A

2095-0756（2017）03-0552-07

浙 江 農 林 大 學 學 報，2017，34（3）：552-558

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.022

2016-06-27；

2016-10-24

浙江省寧波市科技資助項目（2012C10039）

柴曉娟，從事植物分類與資源利用研究。E-mail：540672492@qq.com。通信作者：金水虎，教授，從事植物資源等研究。E-mail：jsh501@163.com