劉甜雨， 王 清， 陳慕雁

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室, 山東 煙臺 264003；3.中國科學院煙臺海岸帶研究所，牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站, 山東 煙臺 264003)

熱刺激對櫛孔扇貝免疫功能和熱休克蛋白表達的影響*

劉甜雨1， 王 清2,3**， 陳慕雁1

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室, 山東 煙臺 264003；3.中國科學院煙臺海岸帶研究所，牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站, 山東 煙臺 264003)

為探究熱刺激對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)免疫功能的影響，以及熱休克蛋白在應對急性高溫脅迫時的作用。本研究對一齡櫛孔扇貝進行28℃熱刺激，采用流式細胞術于0、1、2、4、8 h測定血細胞的吞噬率和活性氧ROS含量；以鰻弧菌和溶壁微球菌為底物測定血清抗菌、溶菌活力；用彗星實驗測定DNA損傷；用AO/EB(吖啶橙/溴化乙啶)熒光染色法檢測細胞凋亡；用熒光實時定量PCR檢測HSP70和HSP90 mRNA相對表達量。研究表明：熱刺激使血細胞中活性氧含量、吞噬活性以及血淋巴抗菌、溶菌活力受到抑制，總體表現為下降趨勢；DNA損傷和細胞凋亡受熱刺激誘導顯著上升，具有明顯的時間-效應關系；HSP70、HSP90 mRNA表達量顯著上調，反應迅速，且HSP70受熱刺激誘導更顯著。研究結果表明，熱刺激導致櫛孔扇貝血細胞發(fā)生細胞凋亡、加劇DNA損傷，造成免疫力下降，而機體通過大量表達熱休克蛋白HSP70、HSP90保護細胞和組織免受損傷。本研究為探究夏季易發(fā)扇貝大規(guī)模死亡原因提供了理論依據。

熱刺激；櫛孔扇貝；血細胞；免疫應答；細胞凋亡；DNA損傷；HSP70；HSP90

櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)是我國淺海筏式養(yǎng)殖的主要對象之一，自1980年代以來，我國北方沿海逐漸形成了以櫛孔扇貝和海灣扇貝為代表的近海貝類養(yǎng)殖業(yè)，成為我國沿海地區(qū)重要的經濟支柱產業(yè)之一。1997年以來，盲目追求高密度養(yǎng)殖使得貝類生存環(huán)境惡化，局部生態(tài)系統失衡，養(yǎng)殖區(qū)病害肆虐，導致櫛孔扇貝大規(guī)模死亡。扇貝大規(guī)模死亡多發(fā)生于夏季較高水溫期間，且由南及北呈傳染病樣波及[1-2]。大量研究發(fā)現，在影響海洋雙殼貝類疾病流行的各種環(huán)境因子中，溫度是影響疾病時空分布的主要因素[3-6]。

在抵御病原體和環(huán)境脅迫時，雙殼貝類的非特異性免疫發(fā)揮著至關重要的作用[7]。其中，細胞吞噬作用是雙殼類免疫防御的主要效應方式[8-11]，細胞吞噬活性已廣泛應用于貝類機體健康狀況的評價，以及衡量環(huán)境或病原脅迫下機體的免疫防御能力[12-15]。伴隨著細胞吞噬，通常會發(fā)生呼吸爆發(fā)，產生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。ROS能夠對病原體產生殺傷作用[12]，是反映生物體是否受到不良因素脅迫的重要指標之一。研究表明，血細胞的吞噬活性和ROS含量對溫度變化十分敏感[16-20]。除血細胞作用外，貝類還會通過細胞分泌到體液中的各種酶類和肽段進行體液免疫。體液因子能夠抑菌、殺菌，包括溶酶體酶、凝集素、抗菌肽和蛋白酶抑制劑等[21]。血清的抗菌、溶菌活力能體現出各體液免疫因子的綜合作用[22]，是衡量生物體液免疫總體水平的一個重要指標。研究表明，急劇水溫變化會影響貝類的免疫功能和抗病力，導致貝類免疫抑制而死亡[18, 23]。

外源性高溫還會導致DNA雙鏈結構破壞、DNA鏈斷裂、堿基或堿基對被切除或替換等DNA損傷[24]。DNA損傷進而會誘導細胞的程序性死亡，即細胞凋亡[25]。細胞凋亡是維持機體正常發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)平衡的一種重要機制，受多種因素誘導發(fā)生[26]。在分子水平上，動物體內利用基因調節(jié)溫度適應性的機制普遍存在，熱脅迫可以誘導動物體內熱休克蛋白基因的大量表達[27]。熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是機體在應激狀態(tài)下細胞迅速合成的一類蛋白質，其生物學特性在提高細胞耐受力和機體熱耐力的研究中具有非常重要的地位，受到人們的普遍關注；另外，因HSPs具有高度的保守性、普遍性和應激性等特性[28]，很多研究者利用其廣泛存在的特點及其與環(huán)境的特殊關系，選擇HSPs作為環(huán)境監(jiān)測的標志物[29]。在熱休克蛋白家族中，HSP70和HSP90是生物抗逆性和抗感染的重要生物分子[30]。

為了扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，需要對貝類生理及抗逆機制有全面、深入、系統的認識，充分了解與應激反應相關的基因和調控機制。目前針對櫛孔扇貝已經開展了生理[31-35]、生態(tài)[36-40]、病害免疫[41-46]、遺傳育種[47, 48]、分子標記[49-53]等多方面研究，但針對扇貝在急性熱脅迫下血淋巴細胞損傷、免疫反應和基因表達的綜合研究尚不多見。本研究重點關注高溫對櫛孔扇貝的急性刺激及其響應機制，通過測定熱刺激對櫛孔扇貝血淋巴細胞的吞噬活性、活性氧水平，抗菌、溶菌活力，DNA損傷，細胞凋亡，以及熱休克蛋白HSP70、HSP90 mRNA的相對表達量，多方面綜合分析高溫刺激在短時間內對櫛孔扇貝造成的機體損傷，從而揭示免疫系統和應激蛋白表達調控的啟動和變化規(guī)律，為探究熱刺激對機體相關免疫指標的影響及機體的應對策略，為探索扇貝大規(guī)模流行性死亡的發(fā)病原因提供理論依據，同時也為養(yǎng)殖貝類環(huán)境脅迫評價體系的構建提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗生物

櫛孔扇貝購自山東省青島市南山市場，均為一齡貝，于實驗室循環(huán)水槽中暫養(yǎng)1周后進行實驗。暫養(yǎng)期間海水溫度控制在15℃，鹽度30，pH 7.6～8.1，連續(xù)充氧，每日投喂螺旋藻2次。

1.2 實驗處理

暫養(yǎng)結束后選取規(guī)格較一致的櫛孔扇貝，直接由暫養(yǎng)溫度轉移到水溫為28 ℃[35,54-55]的海水中，進行急性熱脅迫實驗。實驗過程中，扇貝受外源刺激無閉殼反應時認定為死亡，并立即移除。實驗開始后0(對照組)、1、2、4和8 h分別進行扇貝血細胞取樣，并測定相關實驗指標。每個指標測定的生物學重復為4 ～ 6個個體。

1.3 實驗方法

1.3.1 血淋巴的采集和工作液制備 用預冷的1 mL注射器從每個扇貝閉殼肌中抽取約500 μL血淋巴，置于冰水混合物中，每個取樣時間隨機取扇貝20～30只，每5只混合為一個樣本。將每份混合血淋巴與等量抗凝劑(Glucose：20.8 g·L-1，EDTA：20mmol/L，Sodium chloride：20 g·L-1，Tris-HCl：0.05mol/L，pH=7.4)混勻，防止血細胞凝集，混合溶液用作血淋巴工作液。在使用BD公司生產的FACSVantage流式細胞儀進行檢測活性氧產物和吞噬活性時，為了防止堵塞儀器，血淋巴樣品上樣前必須先以50 μm網目的篩絹過濾，去除雜質。

1.3.2 血細胞活性氧產物 取400 μL血淋巴工作液于實驗離心管中，置于冰水混合物中，加入4 μL的2’7’-二氯熒光黃(DCFH-DA)(終濃度為0.01 mmol/L)，18℃避光撫育1h后上樣。DCFH-DA本身不帶熒光，滲透入細胞后，DCFH-DA被水解為DCFH，結合在細胞內，被胞內的活性氧產物進一步氧化成為具有強熒光的DCF[56-57]，測定活性氧產物的靜息值。DCF熒光值以任意單位表示(A.U.)。

1.3.3 血細胞的吞噬活性 實驗采用經石芳芳等[58]改進后Delaporte[59]的方法，取200 μL血淋巴工作液在4 ℃，780g離心10 min，去上清，沉淀的血細胞用過濾海水重懸，然后加入濃度為0.3%的熒光微球30 μL，18 ℃避光撫育1 h，再加入230 μL 6%的福爾馬林溶液(過濾滅菌海水配置)中止反應，并上樣。血細胞吞噬活性用細胞吞噬率表示，即參與吞噬熒光微球的血細胞占所有吞噬細胞的比率。

1.3.4 血淋巴細胞的溶菌活力 以溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)凍干粉為底物，將菌體用0.1 mol/L、pH=6.4的無菌磷酸鉀鹽緩沖液配成一定濃度的菌懸液(OD570nm≈0.3)，取3 mL菌懸液置于冰浴中，加入100 μL待測培養(yǎng)上清液混勻，于570 nm波長處測定光密度值(A0)，然后置于37℃水浴保溫30 min，取出后立即置于冰浴中10 min終止反應，測光密度值(A)。溶菌活力(UL)按下式計算：

UL=(A0-A)/A。

1.3.5 血淋巴細胞的抗菌活力 用0.1 mol/L、pH=6.4的無菌磷酸鉀鹽緩沖液將鰻弧菌配成一定濃度的菌懸液(OD570nm≈0.3)，取3 mL菌懸液置于冰浴中，加入100 μL待測培養(yǎng)上清液混勻，在570 nm波長處測定光密度值(A0)，然后移入37 ℃水浴中孵育30 min，取出后立即置于冰浴內10 min終止反應，在570 nm波長處測定光密度值(A)。抗菌活力(Ua)按下式計算：

Ua=(A0-A)/A。

1.3.6 血細胞DNA損傷 參照Singh等[60]的方法，略加改進：將1%的正常熔點瓊脂糖100 μL滴加到潔凈的磨砂載玻片上，蓋玻片鋪片，4 ℃凝固10 min，移去蓋玻片；將血細胞懸液10 μL(106cell·mL-1)與90 μL0.6%低熔點瓊脂糖(37 ℃)混勻，取75 μL上述混合液滴加到第一層膠上，蓋玻片鋪片，4 ℃凝固10 min，取下蓋玻片，然后將載玻片水平浸入4 ℃預冷裂解液中裂解2 h；取出載玻片晾干后移入水平電泳槽中，倒入新配置預冷(4 ℃)的電泳緩沖液中避光解旋20 min，然后室溫電泳30 min (電壓25V，電流300 mA)；電泳結束后用0.4 mol·L-1Tris緩沖液(pH=7.4)浸洗膠板2次，每次15 min；20 μg·mL-1溴化乙啶(EB)染色，在熒光顯微鏡(10×40)下觀察，激發(fā)波長510～560 nm，阻斷波長590 nm。每個樣品作3個重復，每張載玻片上隨機觀察100個細胞。采用CASP軟件分析彗星圖像，選擇Olive尾矩(OTM值)用于DNA損傷的評價指標，并根據彗星尾長對DNA損傷程度進行分級[61]：無損傷，<5 μm(0)；輕度損傷，5～25 μm(+)；中度損傷，25～45 μm(++)；重度損傷，>45 μm(+++)。

1.3.7 血細胞凋亡 參照Spector等[62]的方法，取50 μL血細胞懸液，加入6 μL濃度為100 μg·mL-1的AO/EB(吖啶橙/溴化乙啶)染液進行熒光染色，混勻后，將細胞懸液滴加到載玻片上，加蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察計數正?；罴毎麛盗?、凋亡細胞數量、壞死細胞數量，正常細胞被AO染成綠色，壞死的血細胞被EB染成紅色，凋亡初期血細胞呈現橙紅色，并帶有綠色斑點，凋亡末期細胞呈現橙紅色。每個樣品計數200個細胞，按以下公式計算細胞凋亡指數。

凋亡指數=B/(A+B+C)×100%；

早期凋亡率=D/(A+B+C)×100%；

晚期凋亡率=E/(A+B+C)×100%。

式中，字母A、B、C、D、E分別代表正常活細胞數量、凋亡細胞總數量、壞死細胞數量、凋亡早期細胞數量、凋亡晚期細胞數量。

1.3.8 血細胞中熱休克蛋白HSP70和HSP90的mRNA相對定量表達

1.3.8.1 總RNA的提取、純化和反轉錄 為了減小個體間的誤差，每個時間點隨機選取18只扇貝，每3只扇貝的血淋巴作為一個樣品，共設置6個重復。血淋巴樣品于4 ℃，3 000g離心5 min收集血細胞。采用Trizol法提取血細胞總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa，日本)進行總RNA的純化和cDNA的反轉錄。

1.3.8.2熒光定量PCR分析 采用已經發(fā)表的HSP70[63]和HSP90[64]的特異性引物用于基因表達分析，內參基因為β-actin(見表1)。基因相對表達水平采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaPa，日本)檢測；檢測過程在7500 型實時熒光定量PCR系統(Applied Biosystems，美國)上進行。

每個樣品設置3個重復，特異性引物的退火溫度和循環(huán)數經優(yōu)化后如下：95 ℃變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，此步驟循環(huán)40次。在PCR運行結束后制作引物溶解曲線，分析其擴增效率以確保引物特異性和產物的單一性。根據實驗結果，以β-actin為內參基因，根據2-△△CT方法計算得到各基因的相對表達量[65]。

表1 用于基因表達分析的引物信息

1.4 數據處理

流式細胞儀的數據處理采用WinMDIversion28軟件；彗星實驗用CASP分析獲得的數據采用國際常用參數分析方法[66]，結果數值表示為“平均數±標準差”；數據統計采用SPSS17.0和Excel 2010軟件統計分析，用單因素方差分析(One-way，ANOVA)和Duncan's多重比較法對組間進行差異分析，若P<0.05，則定義為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 熱刺激對血細胞內活性氧含量的影響

活性氧水平采用DCF熒光值(AU)表示，實驗結果如圖1所示，熱刺激開始4 h內，扇貝血細胞活性氧水平變化較小；8 h時ROS水平明顯下降，與對照組(0 h)差異顯著(P<0.05)。

(*表示與對照組(0 h)組間差異顯著(P< 0.05)。* Indicates groups significantly different from the controls (P< 0.05).)

2.2 熱刺激對血細胞吞噬活性的影響

櫛孔扇貝血細胞的吞噬活性受高溫脅迫的影響極顯著(P<0.01)。實驗開始時，細胞吞噬率約為21.7%，脅迫2 h內吞噬活性無顯著變化，4 h吞噬活性明顯增大(P<0.05)，吞噬率達到25.8%，熱刺激8 h后，降為23.1%，顯著低于4 h時的吞噬率，并與初始吞噬率差異不顯著(P>0.05)(見圖2)。

2.3 熱刺激對血淋巴細胞溶菌、抗菌活力的影響

櫛孔扇貝血淋巴細胞的抗菌、溶菌活力測定結果見表2，隨時間的變化規(guī)律如圖3所示：血淋巴細胞在不同高溫脅迫時間下，抗菌活力差異不顯著(P>0.05)，對照組(實驗開始0 h)抗菌活力最大，熱刺激6 h內，抗菌活力略有下降，8 h活力降到最小值，并顯著低于對照組(P<0.05)；溶菌活力隨著熱刺激時間的延長變化明顯(P<0.05)，對照組溶菌活力最大，熱刺激后其活力平緩上升后緩慢下降，于實驗開始4 h時與

對照組產生顯著性差異，隨后溶菌活力稍下降并達到最低值(見圖3)。

(小寫字母為Duncan分析結果，含有完全不同字母的表示差異顯著(P< 0.05)。Bars showing different lowercase letters are significantly >different from each other by Duncan analysis (P<0.05).)

熱刺激時間/hStimulustime溶菌活力Bacteriolyticactivities抗菌活力AntibacterialactivitiesA0AULA0AUa00.29±0.010.27±0.010.11±0.020.31±0.010.28±0.010.1±0.0310.37±00.34±0.010.08±0.020.33±0.010.31±0.020.08±0.0320.28±0.010.26±00.09±0.030.33±0.040.3±0.030.08±0.0440.21±00.2±0.010.05±0.030.34±0.020.31±0.020.07±0.02*80.21±0.010.2±0.010.05±0.02*0.33±0.010.31±0.010.04±0.01*

注：*表示與對照組(0 h)組間差異顯著(P< 0.05)。

Note: * indicates groups significantly different from the controls (P< 0.05).

(左側：血淋巴細胞對鰻弧菌的抗菌活力，右側：血淋巴細胞對溶壁微球菌的溶菌活力；*表示抗菌活力在熱刺激8 h后與對照組差異顯著(P< 0.05)；小寫字母為Duncan分析結果，含有完全不同字母的表示差異顯著(P< 0.05)。Left: the antibacterial activity of hemolymph onVibrio anguillarum;Right: the bacteriolytic activity of hemolymph on Micrococcus lysodeikticus. * indicates antibacterial activities significantly different from the controls after 8 h treatment (P< 0.05); Bars showing different lowercase letters are significantly different from each other by Duncan analysis (P< 0.05).)

2.4 熱刺激對血細胞的DNA損傷

高溫脅迫下櫛孔扇貝細胞核彗星圖像如圖4所示。細胞未受高溫脅迫時，較少細胞出現拖尾，細胞核影像基本呈規(guī)則的圓形，邊緣光滑且亮度均勻；高溫脅迫開始即出現明顯的拖尾現象，細胞拖尾現象隨時間推移逐漸明顯：脅迫開始2 h內細胞拖尾尾長較短，4～8 h時，彗星頭部逐漸變小，彗尾變長，呈掃帚狀，且熒光強度增加。如表3顯示，高溫使血細胞DNA受到嚴重損傷，并隨著脅迫時間的延長DNA損傷程度逐漸增大，高溫刺激1 h就達到輕度損傷，實驗結束時達到中度損傷。各時間組的尾長、尾部DNA含量、尾矩和Olive尾矩與對照組比較，差異顯著(P<0.05)，進一步分析表明，1和2 h之間4種參數差異均不顯著，其它各時間組之間均具有顯著差異。

圖4 高溫刺激不同時間櫛孔扇貝血細胞DNA損傷的彗星圖像

熱刺激時間①/h尾長②/μm尾部DNA含量③/%尾矩④Olive尾矩⑤損傷程度⑥01.26±1.934.86±5.80.16±0.610.3±0.60111.01±4.31*15.89±5.41*1.89±1.34*2.56±1.33*+213.41±2.59*17.74±5.9*2.45±1.05*2.74±1.11*+420.94±2.99*23.94±5.91*5.08±1.63*5.24±1.25*+836.13±9.43*32.85±11.07*12.34±7.6*9.6±4.37*++

注：*表示與對照組(0 h)差異顯著(P<0.05)。損傷程度劃分：無損傷，<5 μm(0)；輕度損傷，5～25 μm(+)；中度損傷，25～45 μm(++)；重度損傷，>45 μm(+++)。

Note: * indicates groups significantly different from the controls (P< 0.05). Damage degree: no DNA damage, < 5 μm(0); mild DNA damage, 5～25 μm(+); moderate DNA damage, 25～45 μm (++); severe DNA damage, > 45 μm (+++).

①Stimulus time；②Tail length；③Tail DNA；④Tail moment；⑤Olive tail moment；⑥Damage degree

2.5 熱刺激對血細胞凋亡的影響

熱刺激后，櫛孔扇貝血細胞凋亡指數、早期凋亡率和晚期凋亡率隨時間的延長逐漸增加，并具有統計學意義(P<0.05)，且早期和晚期凋亡率的強度相似(P>0.05)(見圖5)。分析結果顯示，在未進行熱刺激時，扇貝血細胞凋亡指數較低(0.5%)，早期凋亡率和晚期凋亡率相等。熱刺激1 h后，凋亡細胞數量增加，且早期凋亡率大于晚期凋亡率；熱刺激2 h后，血細胞的凋亡指數，早期、晚期凋亡率與對照組產生顯著差異(P<0.05)；到8 h時，凋亡指數最高，達到3.72%，早期凋亡率仍略大于晚期凋亡率，分別為2.02%和1.72%。

2.6 熱刺激下熱休克蛋白HSP70和HSP90的差異表達

利用實時熒光定量PCR技術，檢測櫛孔扇貝受熱刺激后血細胞中HSP70和HSP90基因mRNA相對表達量的變化。如圖6所示，高溫28℃刺激下，HSP70和HSP90基因mRNA表達影響受熱處理時間極顯著(P<0.01)。HSP70轉錄水平隨熱處理時間延長顯著升高，熱刺激4和8 h后，分別增至初始表達量的3.90和7.27倍；HSP90在各取樣時間的轉錄水平差異顯著(P<0.05)，但增長較平緩，8 h后的表達量僅為初始表達量的2.32倍。扇貝血細胞中熱休克蛋白HSP70和HSP90的初始轉錄水平相近，高溫刺激后HSP70轉錄水平的升高速度大于HSP90，且在8 h時產生顯著性差異(P<0.05)。

圖5 高溫刺激后櫛孔扇貝血細胞的細胞凋亡率

圖6 熱刺激下HSP70和HSP90的相對表達量

3 討論

3.1 熱應激對櫛孔扇貝血細胞活性氧含量和吞噬活性的影響

本研究結果顯示，在28℃高溫脅迫8 h內，扇貝血細胞的吞噬活性先下降后升高，在4 h時達到峰值，隨后迅速降低，活性氧含量8h后顯著低于初始水平。分析結果得到，急性高溫刺激使血細胞活性氧產物升高[16]，但一段時間后可能由于持續(xù)高溫脅迫使細胞內活性氧累積增多，損害機體細胞，導致血細胞的死亡率增加，進而造成吞噬活力下降，ROS生產力降低。本研究中細胞凋亡實驗結果可對此解釋提供理論支持：血細胞凋亡率在熱刺激2 h后顯著增加，8 h達到最大。大量研究表明，高溫會使細胞分裂及增殖受到抑制，血細胞數量減少[35]，且顆粒血細胞的數量和比例更易受溫度影響而降低[71]，而顆粒細胞在貝類血細胞中起吞噬作用，這可能是本研究中櫛孔扇貝受到高溫脅迫8 h時血細胞吞噬活力顯著降低的主要原因。同時，細胞吞噬活性與貝類血細胞的表面特征有關，而持續(xù)高溫對細胞表面的受體數量產生影響，也可能是吞噬活性降低的原因之一[16, 19-20, 72]。

3.2 熱刺激對櫛孔扇貝血細胞抗菌、溶菌活力的影響

貝類的體液免疫主要通過細胞分泌到細胞和體液中的各種酶類和肽段來完成，起到異物識別、清除及維持自身內環(huán)境穩(wěn)定的作用。各體液免疫因子的綜合作用可以通過血清的抗菌活力和溶菌活力體現[73]。本研究選用鰻弧菌和溶壁微球菌作為底物，測定了高溫刺激對櫛孔扇貝抗菌、溶菌活力的影響。實驗結果顯示，櫛孔扇貝的血淋巴的抗菌、溶菌活力在28 ℃熱刺激下受到抑制，存在時間—效應關系，并在實驗結束時顯著低于初始活力，但熱刺激剛開始時，抗菌、溶菌活力出現了短暫增強。相關研究也得到了類似的結論，Ottaviani等[74]用細菌注射刺激蝸牛Planorbariuscorneus后，發(fā)現在注射后2 h內細菌清除率最高；Dang等[75]的研究表明，短期水溫升高會使歐洲鮑(Haliotisrubra)的抗菌活力和抗病毒活力上升，但長時間高溫脅迫會導致歐洲鮑抗菌活力和抗病毒活力受到抑制；李曉英等[76]發(fā)現短期溫度驟升能提升青蛤(Cyclinasinensis)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力，但長期高溫刺激會抑制兩種酶活性；時少坤[77]對鮑的研究中發(fā)現，鮑血淋巴堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)活力受高溫刺激(水溫30℃)48 h后均顯著低于對照組。以上研究表明，高溫脅迫會嚴重降低機體免疫酶活力，進而導致機體免疫力降低。

溶菌酶能夠破壞溶解細菌細胞壁中的肽聚糖，具有較強的溶菌能力[78]。其特點之一是底物特異性強，不同來源的溶菌酶作用的底物不同[79]，本實驗結果顯示，當以鰻弧菌為底物時，扇貝血淋巴抗菌活性變化不明顯；而當底物為溶壁微球菌時，其溶菌活力受高溫影響更加顯著?？赡苁怯捎趯嶒炇褂玫啮牷【鸀榫鷳乙?，而溶壁微球菌為凍干粉，后者更容易被溶菌酶降解；或者可能是鰻弧菌和溶壁微球菌細胞壁中的肽聚糖含量不同，造成溶菌酶的降解能力存在差異。

3.3 熱刺激造成櫛孔扇貝血細胞DNA損傷和細胞凋亡

動物體內DNA在受到來自體內外各種因素的刺激時，例如：外源性的高溫高壓、紫外線、射線、重金屬、強氧化劑、強酸和強堿等物理化學因素和內源性ROS、酸堿不平衡及DNA在復制和傳遞過程中出現的錯誤等，會發(fā)生DNA雙鏈結構破壞、DNA鏈斷裂、堿基或堿基對被切除或替換等DNA損傷[24]。DNA損傷還會進一步誘導細胞凋亡。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，存在于多細胞生物的整個生命過程當中，可及時清除機體內多余和受損傷的細胞，是機體內細胞死亡的重要途徑，也是維持機體正常發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)平衡的一種重要機制。

彗星實驗(Comet assay)，又稱單細胞凝膠電泳技術(Single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一種簡便、快速和靈敏的檢測DNA損傷的新方法[80]，目前已廣泛應用于生物監(jiān)測、臨床病理和遺傳毒理學等領域[81-82]。在電泳過程中，損傷的DNA斷鏈及片段分子量小，會離開核DNA向陽極移動，形成彗星狀的圖像，而未損傷的DNA部分保持球形。大多研究認為以OTM(Olive尾矩)為指標的結果最為可靠因為它可以反映尾部的面積、尾部的DNA含量以及尾部的DNA所占總DNA的百分比[83]。

本研究結果表明，隨著熱刺激時間延長，櫛孔扇貝血細胞細胞彗星尾長增加、尾部熒光強度增強，這是說明熱刺激導致血細胞產生數量較多的小DNA斷片，受損較為嚴重。進一步采用尾長、尾部DNA含量、尾矩，Olive尾矩等作為分析指標，結果發(fā)現，高溫刺激(28℃)可導致櫛孔扇貝血細胞DNA受到明顯的損傷，并與高溫脅迫存在時間-效應關系。研究表明，外源性高溫和內源性ROS都是導致動物細胞DNA損傷的因素[24]，但本實驗中，DNA損傷在活性氧含量顯著變化前就已發(fā)生，且損傷程度持續(xù)升高，推測外源性高溫誘導扇貝血細胞DNA損傷作用大于內源性影響因素ROS。細胞凋亡隨時間延長而顯著增加，與DNA損傷的變化規(guī)律相似，這可能是細胞凋亡過程中細胞染色體上DNA發(fā)生特異性降解所致[25]。

3.4 熱休克蛋白HSP70、HSP90對高溫刺激的響應

在動物體內，利用基因調節(jié)溫度適應性的機制普遍存在。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)，又稱為應激蛋白，是機體在應激狀態(tài)下細胞迅速合成的一類蛋白質。當細胞或機體處于正常狀態(tài)時，HSPs主要維持細胞正常的生理機能[84]。當細胞或機體處于應激狀態(tài)時，HSPs大量誘導表達，增加細胞抵抗不良環(huán)境的能力[85]，參與維持細胞內環(huán)境的相對穩(wěn)定[86]。

按照分子量大小，Morimote等[87]將熱休克蛋白分成4個家族：HSP90家族(分子量約83～110 kDa)，HSP70家族(分子量約66～78 kDa)，HSP60家族及小分子量smHSP(分子量約12～43 kDa)家族。其中，HSP90是真核生物體內最豐富的細胞質蛋白之一，參與機體免疫調節(jié)和信號傳導以及細胞周期調控等[88]；HSP70是目前研究比較深入的一種蛋白質，應激狀態(tài)下參與降解錯誤折疊和變性的蛋白質以及其調節(jié)過程[89]，同時還有抗細胞凋亡、抗氧化以及提高細胞耐受力，促進細胞增殖等基本的功能，且在熱休克蛋白家族中，HSP70對環(huán)境的擾動最為敏感[90]。這在本實驗中也得到體現：在受到熱刺激后，HSP70的轉錄水平和增長速度顯著大于HSP90，表明HSP70的誘導受溫度影響更明顯。目前，普遍認為HSP70的細胞保護功能構成了細胞應激耐受的基礎[91-92]。研究表明，熱脅迫可以誘導動物體內HSPs基因的大量表達[93-95]，這在本實驗中得到印證。結果顯示，櫛孔扇貝在受到高溫刺激后，HSP70和HSP90的轉錄水平隨時間均顯著提高，表明扇貝會通過誘導增加HSP70和HSP90基因mRNA的表達應對高溫脅迫，還有研究發(fā)現應激狀態(tài)下HSP70 mRNA主要通過增強其自身的穩(wěn)定性以及優(yōu)先翻譯來保證機體需要[96]。Fehrenbach等[97]發(fā)現高溫環(huán)境中HSPs的表達可以降低DNA損傷，但在本實驗中，DNA損傷一直處于增長狀態(tài)，HSP70、HSP90 mRNA表達量隨時間顯著增加，說明DNA損傷可能是誘導細胞過表達HSPs的原因之一。目前，關于HSPs與細胞凋亡的研究較多，但它們之間的具體關系不是十分清楚。大量研究表明HSPs可以抑制細胞凋亡，HSP70[98]、HSP90[88, 99]可以在凋亡體形成的不同階段發(fā)揮阻斷作用，但Ishiyama等[100]研究發(fā)現如果細胞凋亡已啟動，再用應激因子誘導細胞表達HSPs，HSPs不但不能抵抗細胞凋亡，甚至還可以促進細胞凋亡。

另外，HSP70家族成員眾多，有學者在牡蠣中發(fā)現HSP70基因發(fā)生了明顯擴張，數目高達88個[101]。由于扇貝基因組信息尚未公布，本研究僅對櫛孔扇貝其中一個HSP70基因進行了研究，有關櫛孔扇貝HSP70基因家族其它成員對熱刺激的表達響應機制有待進一步研究。

4 結語

本研究表明，在受到熱刺激后，扇貝會通過非特異性免疫系統應對脅迫，且體液免疫比細胞免疫反應迅速。28℃熱刺激下，外源性高溫誘導扇貝血細胞DNA損傷作用大于內源性影響因素ROS，并可直接誘導細胞凋亡，血細胞凋亡可能是導致細胞吞噬活性下降的重要原因，進而降低血淋巴細胞的免疫、抗菌能力，使扇貝的免疫功能受到嚴重的抑制，為病原體的入侵和繁殖提供可乘之機；同時熱刺激后，熱休克蛋白HSP70和HSP90轉錄水平顯著提高且反應迅速，HSP70的轉錄受溫度影響更明顯，表明誘導熱休克蛋白，特別是HSP70的過量表達，是機體應對熱刺激的重要機制。綜合分析表明，夏季水溫若達到28℃高溫，短時間內即可造成櫛孔扇貝細胞損傷，抗菌能力顯著下降，極易受到病原菌侵害，增大扇貝大規(guī)模死亡的可能性。本研究初步探究了熱刺激后扇貝防御系統的啟動，綜合分析了扇貝對熱刺激的抗逆機制，為探究夏季易發(fā)扇貝大規(guī)模死亡原因提供了理論依據。

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責任編輯 朱寶象

Effect of Thermal Stimulus on Immune Function and Heat Shock Protein Expression of ScallopChlamysfarreri

LIUTian-Yu1,WANGQing2, 3,CHENMu-Yan1

(1.TheKeyLaboratoryofMariculture(OceanUniversityofChina),MinistryEducation,Qingdao266003,China; 2.TheKeyLaboratoryofCoastalZoneEnvironmentProcessesandEcologicalRemediation,YantaiInstituteofCoastalZoneResearch,ChineseAcademyofSciences,Yantai264003,China; 3.MupingCoastalEnvironmentResearchStation,YantaiInstituteofCoastalZoneResearch,ChineseAcademyofSciences,Yantai264003,China)

The objective of this study was to evaluate the effect of thermal stimulus on the scallop,Chlamysfarreri, which was generally recognized as a temperature sensitive bivalve species. Immune response, DNA damage, apoptosis and transcription of heat shock protein (HSP70 and HSP90) genes in hemocytes were evaluated over a short period of thermal stimulus. The hemocyte of scallops was obtained on 0, 1, 2, 4, 8 h after being treated at 28 ℃. By using flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) production and phagocytosis activity of hemocytes were estimated. The results demonstrated that both ROS and phagocytosis activity reached the highest level in 4 h and reduced markedly by 8 h. The stress also significantly decreased antibacterial and bacteriolytic activities. By contrast, the DNA damage (mainly DNA breakages) level in hemocytes as was detected by the alkaline comet assay increased following high-temperature exposure, and hemocyte apoptosis was observed under fluorescence microscope. Significant increases in the transcription of HSP70 and HSP90 genes were also detected in hemocytes, while the transcription of HSP70 grew faster than HSP90 did and reached to a higher level. This study demonstrated that immune response, DNA damage level and apoptosis of hemocytes in the scallop were strongly affected within several hours, and the transcripts of HSPs genes were strengthe-ned so as to protect the cells and tissues from injury whenC.farrerisubjected to short-term high temperature stressing.

thermal stimulus;Chlamysfarreri;hemocyte; immune response; apoptosis; DNA damage; HSP70; HSP90

山東省自然科學基金項目(ZR2012CQ016)；中國科學院海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室開放基金項目(KLMEES201301)；中國科學院青年創(chuàng)新促進會項目(2016196)資助 Supported by Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2012CQ016)；Open Fund of Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science，Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences (KLMEES201301)；Youth Innovation Promotion Association of CAS (2016196)

2016-10-26；

2017-01-19

劉甜雨(1992-)，女，碩士生。E-mail：liutianyu_92@163.com

** 通訊作者：E-mail：qingwang@yic.ac.cn

S917.4

A

1672-5174(2017)08-031-13

10.16441/j.cnki.hdxb.20160366

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