麥旦提, 楊 嬋, 薛 蕓, 王 彥, 閻 超

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200210)

研究論文

基于花生四烯酸代謝通路研究水飛薊素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)炎癥模型影響

麥旦提, 楊 嬋, 薛 蕓, 王 彥*, 閻 超*

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200210)

以脂多糖類似物(KLA)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象,采用代謝組學(xué)研究手段,研究水飛薊素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)炎癥模型中花生四烯酸代謝通路的影響。以超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用為平臺(tái),對(duì)不同濃度水飛薊素作用下KLA誘導(dǎo)RAW264.7炎癥細(xì)胞分泌的類二十烷酸代謝物進(jìn)行定量分析,通過(guò)考察主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)的VIP值和Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯著性差異(P)值篩選代謝標(biāo)記物。建立了59種類二十烷酸(含15種同位素內(nèi)標(biāo))在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法;確定了細(xì)胞存活率在58%～80%的水飛薊素濃度為50～150 μmol/L;篩選出數(shù)據(jù)處理結(jié)果同時(shí)滿足變異權(quán)重參數(shù)(VIP)值>1且結(jié)果P值<0.05的類二十烷酸代謝標(biāo)記物12-OxoLeukotriene B4(12-OxoLTB4);通過(guò)分析柱狀圖和炎癥信號(hào)通路,確定水飛薊素借助其抗氧自由基特性發(fā)揮抗炎作用,通過(guò)抑制脂氧合酶-5 (5-LOX)的活性及阻斷5-LOX代謝通路中產(chǎn)生氧自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)減少氧自由基及過(guò)氧化物的形成。綜上所述,所建立的方法能快速準(zhǔn)確地定量分析多種類二十烷酸,并從代謝組學(xué)角度解釋了水飛薊素的抗炎機(jī)制。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;類二十烷酸;同位素內(nèi)標(biāo);水飛薊素;代謝組學(xué);炎癥

炎癥是人類多種疾病中最常見(jiàn)的一種病理過(guò)程,在機(jī)體的任何部位和任何組織均有可能發(fā)生,而花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)是產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的主要網(wǎng)絡(luò)。類二十烷酸(eicosanoids),也稱類花生酸,是一大類由二十碳的多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的具有生物活性的物質(zhì)。類二十烷酸是體內(nèi)重要的炎癥因子,參與機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)過(guò)程,并在許多疾病的病理生理過(guò)程中起著重要的作用。

中藥因其具有抗炎效果好、不良反應(yīng)少、來(lái)源豐富等優(yōu)勢(shì),在抗炎藥物的開(kāi)發(fā)中越來(lái)越受到人們的重視。水飛薊(SilybummarianumL. Gaertn.)原產(chǎn)于南歐、北非[1],在歐洲是一種民間草藥,用于肝膽疾病的治療,并已成為世界各國(guó)使用的保肝植物藥。水飛薊素(silymarin, Sily)是從水飛薊種子中提取的一種黃酮木脂素類化合物,是一種淡黃色粉末狀物質(zhì),主要活性成分有水飛薊賓(silybin)、異水飛薊(isosilybin)、水飛薊寧(silydianin)、水飛薊亭(silychristin)。其中,以水飛薊賓含量最高,活性也最強(qiáng),具有保肝利膽、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基、抗輻射、抗腫瘤、降血脂和抗胃潰瘍等藥理學(xué)效應(yīng)[2]。此外水飛薊素還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。Fiebrich和Koch[3]報(bào)道了水飛薊素的抗炎作用源于其抗氧自由基的作用,另外還有研究[4]采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了水飛薊素可以通過(guò)抑制脂氧合酶-5 (5-LOX)通路的過(guò)氧化酶的活性發(fā)揮抗炎作用。

類二十烷酸的分析方法有酶免疫分析法、液相色譜分析法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法等。三重四極桿質(zhì)譜儀是類二十烷酸定量分析最常用的分析儀器,具有很好的靈敏度和專屬性[5]。由于類二十烷酸的結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)羧基,在質(zhì)譜電離過(guò)程中易帶負(fù)電,因此,在液相色譜-質(zhì)譜的聯(lián)用分析中,通常選用負(fù)離子模式。三重四極桿質(zhì)譜具有強(qiáng)大的定量能力,其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)的采集模式通過(guò)選擇性地采集母離子(precursor ion)和相對(duì)應(yīng)的特征子離子(product ion),可以對(duì)共流出的不同種類的類二十烷酸和同分異構(gòu)的類二十烷酸進(jìn)行選擇性檢測(cè)[6]。故本次實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定類二十烷酸。

脂質(zhì)組學(xué)的概念于2003年首次被提出,它作為代謝組學(xué)的一個(gè)分支對(duì)所有脂類物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究[7,8]。脂肪酸是脂質(zhì)的一個(gè)重要組成部分,脂肪酸及其氧化代謝物(類二十烷酸)參與生命體內(nèi)的多種生理調(diào)節(jié)過(guò)程。而組學(xué)作為一種系統(tǒng)的研究方法,能直接反映體內(nèi)生物化學(xué)過(guò)程和狀態(tài)變化[9],因此,針對(duì)炎癥的研究,從組學(xué)角度對(duì)脂肪酸及其氧化代謝產(chǎn)物類二十烷酸進(jìn)行研究,能直接反映并且更準(zhǔn)確地解釋抗炎成分在炎癥中的作用機(jī)制,有助于對(duì)炎癥發(fā)生、發(fā)展、治愈的認(rèn)識(shí)。目前還沒(méi)有從代謝組學(xué)的角度去解釋和驗(yàn)證水飛薊素抗炎作用的研究。本研究基于超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜平臺(tái),優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),建立了針對(duì)59種花生四烯酸代表性代謝物的定量分析方法;以Kdo2-Lipid A誘導(dǎo)下的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型為研究對(duì)象,優(yōu)化中藥活性作用炎癥模型濃度,并采用目標(biāo)組學(xué)方法,研究水飛薊素影響脂多糖誘導(dǎo)炎癥模型細(xì)胞中類二十烷酸的代謝變化,闡述水飛薊素活性成分的抗炎活性作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(ACQUITYTMUPLC,美國(guó)沃特世公司;SCIEX Triple QuadTM5500 System,美國(guó)愛(ài)博才思公司),低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠), REACTI-THERM III氮?dú)獯蹈蓛x(賽默飛世爾科技有限公司), SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司), SPE真空抽濾裝置(德國(guó)CNW科技公司),倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司), CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司), Costar六孔板培養(yǎng)皿和100 mm×20 mm培養(yǎng)皿(康寧公司),Strata-X固相萃取柱(美國(guó)菲羅門科學(xué)儀器有限公司)。

44種類二十烷酸及15種氘代類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)艾美捷公司,色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)自德國(guó)默克化工,色譜級(jí)異丙醇、無(wú)水乙醇和乙酸購(gòu)自德國(guó)CNW科技公司。水飛薊素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(純度≥80%, 批號(hào)65666-07-1)。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Gibco無(wú)酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)、雙抗(青霉素-鏈霉素)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司,RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 建立脂多糖類似物(KLA)誘導(dǎo)的炎癥模型及水飛薊素干預(yù)RAW264.7細(xì)胞的濃度篩選

使用含10%(v/v)FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5%(v/v) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中,使每孔中的細(xì)胞數(shù)為1×104,待細(xì)胞貼壁后,分為正常組、炎癥組、藥物處理組5組,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。藥物處理組加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基使其總體積達(dá)到100 μL,正常組和炎癥組加入等體積空白培養(yǎng)基,1 h后,除正常組外,其他組均加入KLA致炎,終質(zhì)量濃度為100 ng/mL,加藥組的水飛薊素終濃度分別為20、50、100、150、200 μmol/L。經(jīng)過(guò)藥物刺激24 h后,再在每孔中加入20 μL 5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽(MTT)的PBS溶液,繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,用2 mL的針頭小心棄去孔板中的上清液,再在每孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)充分振蕩,溶解沉積在細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan),使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度(吸光度,OD值)。

1.3 水飛薊素干預(yù)下的KLA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中類二十烷酸的代謝分析

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔板中,使每孔中的細(xì)胞數(shù)為5×105,待細(xì)胞貼壁后,分為正常組、炎癥組、低濃度藥物處理組、中濃度藥物處理組、高濃度藥物處理組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。藥物處理組加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基使其總體積達(dá)到2 mL,正常組和炎癥組加入等體積空白培養(yǎng)基,放置在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1 h后,除正常組外,其他組均加入KLA致炎,使終質(zhì)量濃度為100 ng/mL,正常組加入等量磷酸鹽緩沖液,此時(shí)加藥組中水飛薊素的終濃度為50、100和150 μmol/L。將以上各組樣品放置在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基中類二十烷酸的提取方法

藥物作用結(jié)束后,吸取細(xì)胞培養(yǎng)基,以800 r/min低速離心5 min,以去除培養(yǎng)基中的細(xì)胞殘骸。吸取上清液,加入100 μL 0.1 ng/μL氘代類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,渦旋混勻后進(jìn)行固相萃取。RAW264.7細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗兩遍,吹打,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

固相萃取:分別使用3 mL甲醇和3 mL水對(duì)Strata-X固相萃取柱進(jìn)行清洗和預(yù)平衡。上樣后,加入2 mL 10%(v/v)的甲醇水溶液進(jìn)行洗滌,以去除雜質(zhì),最后,使用1 mL甲醇對(duì)固相萃取柱上的類二十烷酸進(jìn)行洗脫。收集洗脫液,氮?dú)獯蹈?并用100 μL流動(dòng)相A相復(fù)溶后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.5 UPLC-MS/MS條件

UPLC條件 ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A相為乙腈-水-乙酸(60∶40∶0.02, v/v/v),流動(dòng)相B相為乙腈-異丙醇(50∶50, v/v);柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min。洗脫梯度:0～0.7 min, 0.1%B～20%B; 0.7～4.0 min, 20%B～55%B; 4.0～4.5 min, 55%B～99%B; 4.5～5.0 min, 99%B。進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);負(fù)離子模式掃描;MRM模式監(jiān)測(cè);氣簾氣(CUR)壓力、霧化氣(GS1)壓力和輔助氣(GS2)壓力分別為172.4、310.3和310.3 kPa,離子源電壓為-4.5 kV,離子源溫度為550 ℃,射入電壓(EP)為-10 V,碰撞室射出電壓(CXP)為-20 V。

1.6 類二十烷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品配制為2.5 ng/μL類二十烷酸的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取不同量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入不同體積無(wú)水乙醇稀釋到60 μL,類二十烷酸質(zhì)量梯度分別為0.005、0.015、0.025、0.035、0.05、0.15、0.25、0.35、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 ng,并分別加入10 μL 0.1 ng/μL的氘代類二十烷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為內(nèi)標(biāo)。

1.7 定量分析方法

類二十烷酸定量分析方法采用內(nèi)標(biāo)法,并使用氘代類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)。以類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品與其對(duì)應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)的峰面積比值和類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品含量進(jìn)行線性回歸,得到線性回歸方程,用于后續(xù)樣品中類二十烷酸濃度的計(jì)算。定量下限為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn),在本研究建立的類二十烷酸定量分析方法中,定量下限應(yīng)使信噪比(S/N)大于7[10]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

將UPLC-MS/MS分析獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)Analyst 1.6.2軟件進(jìn)行峰識(shí)別和峰面積積分,并進(jìn)行手動(dòng)積分校正,得到類二十烷酸及其氘代內(nèi)標(biāo)的峰面積比值,再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到不同藥物濃度處理組、炎癥組和正常組的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中類二十烷酸的含量。

將新數(shù)據(jù)表導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 (Umetrics, Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)變量分析。新數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。在OPLS-DA分析中,花生四烯酸代謝產(chǎn)物含量的變異權(quán)重參數(shù)(VIP)>1的變量對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的分離有影響。此外,通過(guò)SPSS軟件(版本IBM 20.0)的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)來(lái)確定代謝物差異在單因素分析水平上是否存在顯著性差異(P<0.05)。由VIP>1和P<0.05獲得不同實(shí)驗(yàn)組類二十烷酸的代謝標(biāo)記物。

2 結(jié)果與討論

2.1 類二十烷酸的定量分析方法的建立

2.1.1 類二十烷酸

類二十烷酸可由omega-3多不飽和脂肪酸和omega-6多不飽和脂肪酸氧化生成。例如,多不飽和脂肪酸經(jīng)環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX)氧化可生成前列腺素(prostaglandins, PGs)和血栓烷素類(thromboxane, TXs),經(jīng)LOX氧化可生成白三烯(leukotrienes, LTs),經(jīng)細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)氧化可生成羥基二十碳四烯酸類(hydroxyeicosatetraenoic acids, HETEs),經(jīng)非酶途徑氧化可生成異構(gòu)的前列腺素(iso-PGs)。而以上類別的類二十烷酸在生命體內(nèi)發(fā)揮著重要作用,是重要的炎癥因子,在炎癥發(fā)生時(shí),參與多種抗炎和促炎反應(yīng)。

為了全面完整地闡述水飛薊素的抗炎機(jī)理,選擇了不同氧化途經(jīng)、不同類別的類二十烷酸共44種,以期覆蓋較多的類二十烷酸代謝途徑。44種類二十烷酸及15種氘代類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品氧化途徑等見(jiàn)表1。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇同位素稀釋定量法[11]對(duì)類二十烷酸進(jìn)行定量分析,選擇氘代類二十烷酸作為內(nèi)標(biāo)是類二十烷酸分析方法建立的一個(gè)關(guān)鍵部分。氘代的類二十烷酸和其對(duì)應(yīng)的類二十烷酸具有相似的結(jié)構(gòu),在色譜柱上保留時(shí)間相近,但其母離子和/或子離子質(zhì)荷比并不相同,是內(nèi)標(biāo)的最佳選擇。由于部分類二十烷酸并無(wú)商品化的氘代對(duì)照品,本研究選擇與其具有相似結(jié)構(gòu)的氘代類二十烷酸作為內(nèi)標(biāo)。例如,11-HETE目前沒(méi)有商品化的氘代標(biāo)準(zhǔn)品,而(d8) 12-HETE的結(jié)構(gòu)與11-HETE類似,因此選用(d8) 12-HETE作為11-HETE的內(nèi)標(biāo)。在本研究中,共選用15種氘代類二十烷酸作為44種類二十烷酸的內(nèi)標(biāo)。本研究所使用的類二十烷酸及其對(duì)應(yīng)氘代內(nèi)標(biāo)見(jiàn)表1。

表 1 44種類二十烷酸及15種同位素內(nèi)標(biāo)的MRM離子對(duì)、優(yōu)化參數(shù)、氧化途徑及保留時(shí)間

表 1 (續(xù))

DP: declustering potential; CE: collision energy. LOX: lipoxygenase; COX: cyclooxygenase; CYP: cytochrome P450; NE: non-enzymatic; -: no pathway.

2.1.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

精密吸取適量類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和氘代類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在MS Q1 模式下選擇母離子，在product MS2 模式下，選擇合適的碎片離子作為特征子離子，并通過(guò)優(yōu)化解簇電壓(DP)，碰撞能量(CE)，使特征子離子和母離子的響應(yīng)值比約為2:1，確定了44種類二十烷酸及15種氘代類二十烷酸的母離子，特征子離子及其優(yōu)化后的DP、CE見(jiàn)表1。其中，一個(gè)類二十烷酸的母離子存在許多子離子，選擇的特征子離子應(yīng)該能與其他共流出的類二十烷酸區(qū)分且響應(yīng)值至少是母離子響應(yīng)值的2倍。

由于共流出的類二十烷酸的MRM離子對(duì)(母離子和特征子離子)并不相同,而MRM離子對(duì)相同的類二十烷酸的色譜保留時(shí)間不相同(59種類二十烷酸的保留時(shí)間見(jiàn)表1),因此,結(jié)合編程的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(scheduled multiple reaction monitoring, sMRM)的智能優(yōu)化和UPLC的高分離度,可以提高類二十烷酸的選擇性,可以較好地區(qū)分共流出的類二十烷酸和MRM離子對(duì)相同的類二十烷酸,實(shí)現(xiàn)類二十烷酸分析的高選擇性和高靈敏度。在本研究中,每一種MRM離子對(duì)保留時(shí)間的駐留時(shí)間窗口設(shè)置為30 s。

在1.5節(jié)條件下,59種類二十烷酸在5 min內(nèi)達(dá)到較好的分離,且具有較優(yōu)的峰形(見(jiàn)圖1)。

2.1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

線性關(guān)系和定量下限 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,39種類二十烷酸的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,說(shuō)明39種類二十烷酸在該濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。除花生四烯酸和PGJ2外,類二十烷酸的定量下限均為5 pg,說(shuō)明該方法具有較好的靈敏度?；ㄉ南┧岷蚉GJ2的定量下限為15 pg。這可能與花生四烯酸和PGJ2的電離效率有關(guān)。類二十烷酸的線性范圍均為0.005～5 ng,定量下限及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

圖 1 59種類二十烷酸標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of a mixture of 59 eicosanoid standards

CompoundLLOQ/pgR2LQC(0.15ng)RE/%RSD/%MQC(1.5ng)RE/%RSD/%HQC(5ng)RE/%RSD/%6kPGF1α50.9976-4.72210.2522-8.58438.8918-3.14334.3212TXB250.99492.22272.09660.44329.2749-2.93405.7257PGF2α50.99672.11480.7356-5.137512.06272.56384.1856PGE250.99792.15285.8916-3.03661.4102-6.79819.3557PGD250.99953.88632.76414.34370.27363.82410.223011βPGE250.99504.48870.1168-8.72668.85732.40925.858711-HETE50.99732.17612.4030-13.698810.40685.86305.629413-HDoHE50.99632.11480.3156-4.47698.2689-3.38155.2375PGJ2150.99344.56091.57234.57458.0483-3.43340.50225-isoPGF2αVI50.99851.07990.6344-11.98663.92548.69871.3130LTB450.99650.639113.66573.719514.27182.65905.9343LTE450.99921.15727.3474-9.945911.7313-5.10118.118413-HOTrE50.99865.71622.4088-0.212212.64450.07287.369615-OxoETE50.99931.90500.2446-9.06411.0013-6.43194.374212(13)-EpOME50.9965-5.65324.8192-1.31861.10021.75407.0135AA150.9995-2.31930.7857-0.00393.4808-3.17974.5341Adrenicacid50.995812.58918.1969-6.06011.16170.49157.5641EPA50.99921.75662.2409-0.88659.8930-5.24635.8692DHA50.99832.08927.1121-0.212511.7450-7.28680.0958dhkPGE250.9963-7.928612.95076.49443.69970.99469.2837dhkPGF2α50.9976-7.011511.27461.04168.3187-1.17505.5418dhkPGD250.99294.48600.21696.14107.6934-1.31183.528915dPGD250.99948.61003.2003-4.721512.1888-3.13764.314815kPGE250.99894.49130.02985.52593.7252-1.08722.351215dPGJ250.99261.42177.143914.37168.2011-6.44365.950820ohPGF2α50.99381.54583.7255-5.56595.6998-4.03413.311120ohPGE250.99980.559210.221812.16389.7347-7.26305.159119ohPGE250.969010.84521.2588-1.41406.86682.29497.137212-OxoETE50.9980-13.86691.42081.14445.97800.15540.828211(12)-EET50.9984-5.14155.76324.31172.0757-1.87706.11855-OxoETE50.9993-13.73365.6765-0.389513.7611-11.98408.90415(S)-HETE50.9992-13.92864.0172-5.02310.80600.47173.8146LTB450.99941.769512.3631-4.42995.7733-11.383910.02356tLTB450.99941.61050.3121-3.22294.6804-4.17807.117712(S)-HETE50.99911.02220.3010-8.06952.4901-7.52695.925712epiLTB450.9958-9.80451.4847-5.741711.3159-17.897011.1488

表 2 (續(xù))

準(zhǔn)確度和精密度 在1.5節(jié)條件下,對(duì)類二十烷酸高、中、低3個(gè)水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行精密度和準(zhǔn)確度分析,結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)于低水平(0. 15 ng)和中水平(1.5 ng)質(zhì)控樣品,衡量準(zhǔn)確度的相對(duì)偏差(RE)和衡量精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)[10]均不超過(guò)±15%;對(duì)于高水平質(zhì)控樣品(5 ng),除5-OxoETE和12epiLTB4的RE外，其他類二十烷酸的RE和RSD均不超過(guò)±10%,均符合要求,這說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

圖 2 不同濃度的水飛薊素對(duì)KLA誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞生存率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of different concentrations of silymarin on KLA induced inflammation cell survival rate (n=5)

2.2 水飛薊素作用KLA誘導(dǎo)RAW264.7炎癥模型濃度范圍的篩選

為尋找合適的抗炎活性成分對(duì)KLA誘導(dǎo)RAW264.7炎癥模型作用的加藥濃度,本研究采用MTT考察了不同濃度的水飛薊素對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響。圖2為不同濃度水飛薊素對(duì)KLA誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞生存率的影響,觀察可知初選的5個(gè)濃度水平下細(xì)胞存活率曲線都處在高存活率范圍且曲線平滑,故水飛薊素后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的藥物濃度范圍可以直接從預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度中選擇,最終確定水飛薊素使細(xì)胞存活率為58%～80%的濃度為50、100和150 μmol/L。另外,根據(jù)MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果,也可推測(cè)水飛薊素對(duì)炎癥細(xì)胞作用溫和,且具有一定的保護(hù)作用,所以即使其濃度升高,細(xì)胞存活率也沒(méi)有明顯下降,這也從側(cè)面說(shuō)明了水飛薊素的抗炎活性。

2.3 不同濃度水飛薊素干預(yù)下的KLA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中類二十烷酸的代謝分析

因?yàn)楸狙芯克鶞y(cè)定的是KLA作用24 h后的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中的類二十烷酸,PGs及其下游代謝產(chǎn)物是AA在炎癥中的重要代謝物,根據(jù)Buczynski等[12]的研究,PGs及其下游代謝產(chǎn)物在KLA刺激24 h后的細(xì)胞內(nèi)含量極低,絕大部分分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中,故本研究主要對(duì)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中的類二十烷酸進(jìn)行相關(guān)分析研究。

基于UPLC-MS/MS分析方法,得到水飛薊素處理組、炎癥組和正常組的RAW264.7細(xì)胞中類二十烷酸濃度的多元統(tǒng)計(jì)變量分析結(jié)果,圖3a、3b為PCA-X及OPLS-DA的結(jié)果,200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)結(jié)果(response permutation testing, RPT)圖略。

圖3a分別顯示了水飛薊素5組樣本的UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)PCA降維后的得分圖。說(shuō)明每類分組中組內(nèi)樣本的類二十烷酸的水平比較相近。為了進(jìn)一步消除非疾病因素及其他潛在隨機(jī)誤差帶來(lái)的影響,故對(duì)PCA-X得分圖進(jìn)行正交濾噪處理,獲取OPLS-DA得分圖(圖3b),這樣可對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最優(yōu)化區(qū)分,凸顯其差異性,模型驗(yàn)證特異性與敏感性較高[13]。從圖3中可以清楚地看到水飛薊素的炎癥組、低濃度藥物處理組、中濃度藥物處理組、高濃度藥物處理組、正常組得到了更好的分離,并且可以觀察到隨著炎癥組、低濃度藥物處理組、中濃度藥物處理組、高濃度藥物處理組、正常組的變化,整體有向右遷移的趨勢(shì)。另外,各個(gè)模型都具有較好的預(yù)測(cè)能力及總體變化解釋能力。同時(shí),200次排序響應(yīng)的結(jié)果顯示:R2(CUM)=(0.0,0.533)，Q2(CUM)=(0.0,-0.192),均小于原始值,且Q2(CUM)回歸直線與Y軸截距<0,進(jìn)一步驗(yàn)證各模型是有效、可信的。

圖 5 炎癥狀態(tài)以及水飛薊素干預(yù)后AA的LOX代謝通路變化Fig. 5 Changes of arachidonic acid metabolic LOX pathways between inflammation and treated by silymarin 5-HPETE: 5-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid.

圖 3 不同濃度水飛薊素干預(yù)下的多元統(tǒng)計(jì)變量分析結(jié)果Fig. 3 Multivariate statistical variables analysis results under different concentrations of silymarin (Sily) intervention a. principle component analysis (PCA)-X model; b. orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) model.

選擇OPLS-DA分析中VIP大于1的差異變量,并結(jié)合單維統(tǒng)計(jì)分析(秩和檢驗(yàn)),將VIP>1且P< 0.05的代謝物作為炎癥組、藥物處理組、正常組的代謝標(biāo)記物,得到一種類二十烷酸代謝標(biāo)記物12-OxoLTB4。從花生四烯酸的代謝通路來(lái)看,代謝標(biāo)記物12-OxoLTB4可以歸于5-LOX通路,可以結(jié)合代謝通路及差異代謝物12-OxoLTB4解釋水飛薊素的抗炎機(jī)制。

2.4 水飛薊素關(guān)鍵差異代謝物的生物學(xué)意義闡釋

為了更加方便地表示代謝標(biāo)記物的含量變化,水飛薊素影響下代謝標(biāo)記物12-OxoLTB4的柱狀圖見(jiàn)圖4。代謝物12-OxoLTB4在炎癥組的含量高于其他組,在加藥組Silymarin-50 μmol/L組、Silymarin-100 μmol/L組和Silymarin-150 μmol/L組中的含量逐漸降低。

圖 4 12-OxoLTB4在水飛薊素干預(yù)下不同組別間的質(zhì)量濃度變化(n=3)Fig. 4 Mass concentration changes of 12-OxoLTB4between different groups under silymarin intervention (n=3)

為了更直觀地表現(xiàn)炎癥狀態(tài)下及水飛薊素干預(yù)下LOX代謝通路的變化,繪制了水飛薊素對(duì)LOX代謝通路的影響,見(jiàn)圖5。從代謝差異物12-OxoLTB4的柱狀圖分析中得知,處于炎癥狀態(tài)時(shí),代謝物12-OxoLTB4的含量升高。原因可從5-LOX代謝通路解釋。首先,圖5展示了AA在5-LOX通路上的代謝過(guò)程,在5-LOX的雙加氧作用下,AA可被催化氧化為5-羥過(guò)氧化二十碳四烯酸(5-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid, 5-HPETE),隨后轉(zhuǎn)化成5-HETE或進(jìn)一步被氧化形成不穩(wěn)定的環(huán)氧化物白三烯A4(leukotriene A4, LTA4),然后LTA4可以轉(zhuǎn)化成LTB4, LTB4再轉(zhuǎn)化為12-OxoLTB4。5-LOX在細(xì)胞靜息狀態(tài)時(shí)表達(dá)很少,而受到外部刺激時(shí)被活化[14], 從而促進(jìn)環(huán)氧化物L(fēng)TA4的合成,12-OxoLTB4為L(zhǎng)Ts的下游代謝產(chǎn)物,所以這可能是12-OxoLTB4的含量在炎癥時(shí)升高的原因。

另外,在炎癥發(fā)生時(shí),會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基,這些氧自由基不僅能增加血管的通透性,而且會(huì)攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸,引起脂質(zhì)過(guò)氧化,造成生物膜損傷[15]。AA在5-LOX的作用下,通過(guò)雙加氧作用,產(chǎn)生性質(zhì)較活潑的脂質(zhì)過(guò)氧化自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物。脂質(zhì)過(guò)氧化物可進(jìn)一步代謝為白三烯、羥基脂肪酸、脂氧素等具有生物活性的物質(zhì)。這些物質(zhì)在炎癥過(guò)程中起重要作用[16]。

水飛薊素為抗氧自由基活性物質(zhì),其抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí),故可以認(rèn)為其抗炎作用源于抗氧自由基[17]。Gupta等[4]研究證實(shí)水飛薊素可以通過(guò)抑制5-LOX的活性發(fā)揮抗炎及抗關(guān)節(jié)炎作用;文獻(xiàn)[4]還提到Baumann等認(rèn)為水飛薊素可以在AA的LOX代謝通路的許多步驟中發(fā)揮清除自由基的功能,故可以總結(jié)如下:水飛薊素通過(guò)抑制5-LOX酶的活性及阻斷5-LOX代謝通路中產(chǎn)生氧自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)減少氧自由基及過(guò)氧化物的形成,從而發(fā)揮抗炎作用,因此其抗炎作用源于其抗氧自由基性質(zhì)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了59種類二十烷酸在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離的LC-MS/MS方法,并利用該定量分析方法和多變量數(shù)據(jù)分析手段,研究了不同濃度水飛薊素干預(yù)下KLA誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的代謝組學(xué),得到一種類二十烷酸標(biāo)記物12-OxoLTB4;通過(guò)柱狀圖分析,結(jié)合炎癥信號(hào)通路,確定水飛薊素借助其抗氧自由基特性發(fā)揮抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)從組學(xué)角度對(duì)脂肪酸及其氧化代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,能更準(zhǔn)確地解釋其在疾病中的作用機(jī)制,有助于疾病的診斷和治療。

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Shanghai Science and Technology Commission Scientific Research Project (Nos. 15142200200, 16142200300); China Postdoctoral Science Fund (No. 2015M581628); Shanghai Introduction of Technology Absorption and Innovation (No. XC-ZXSJ-02-2016-11).

Investigation on silymarin impact on lipopolysaccharide induced inflammation model based on arachidonic acid metabolism pathway

MAI Danti, YANG Chan, XUE Yun, WANG Yan*, YAN Chao*

(SchoolofPharmacy,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200210,China)

The objective of this research is to investigate the suppressive effect of silymarin on vitro cell culture model of inflammatory macrophage RAW264.7 induced by Kdo2-Lipid A, and explore its mechanism based on cell metabonomics. Ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was used in the cell metabonomic assay to quantitative analysis of metabolites related to eicosanoids pathway. Then chemometric approaches such as principal component analysis were used to process the metabolic data. Within the established method, a total of 59 eicosanoids standards (containing 15 deuterated internal standards) were simultaneously separated in a single 5 min run, and the analytical method is proved to be rapid, sensitive and accurate. Whereafter, the metabolites with VIP>1 andPvalue<0.05 were considered as biomarkers. 12-OxoLeukotriene B4(12-OxoLTB4) was eventually identified as metabolic biomarkers of silymarin treatment group in this research, and according to the related inflammatory pathways, we speculated silymarin has anti-inflammatory activities by inhibiting the 5-lipoxygenase (5-LOX) activity and blocking lipid peroxidation in 5-LOX metabolic pathways to reduce the formation of peroxides and oxygen free radicals. This study provide a novel approach to the mechanism research on the silymarin treatment on RAW264.7 cells based on cell metabonomics.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); eicosanoids; deuterated internal standards; silymarin; metabonomics; inflammatory

10.3724/SP.J.1123.2017.01026

2017-01-20

上海市科委科研計(jì)劃項(xiàng)目(15142200200,16142200300);中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M581628);上海市引進(jìn)技術(shù)的吸收與創(chuàng)新專項(xiàng)(XC-ZXSJ-02-2016-11).

O658

A

1000-8713(2017)06-0578-09

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(021)34204833,E-mail:chaoyan@unimicrotech.com(閻超);Tel:(021)34205673,E-mail:wangyan11@sjtu.edu.cn(王彥).