鄧欣鑫 張瑤瑤 虞麗娜 朱霞琳 薛曉婷 趙 瑩

(泰山醫(yī)學院藥學院，山東 泰安 271016)

HPLC法測定通脈止渴膠囊中葛根素含量*

鄧欣鑫 張瑤瑤 虞麗娜 朱霞琳 薛曉婷 趙 瑩*

(泰山醫(yī)學院藥學院，山東 泰安 271016)

目的 建立HPLC法測定通脈止渴膠囊中葛根素的含量。方法 采用Synergi4u Hydro-RP80A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇—0.1%磷酸溶液(25∶75)為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長250 nm，柱溫25 ℃。結果 HPLC法測定：葛根素溶液在0.0369～0.5529 μg/ml之間與峰面積呈良好的線性關系(r=1)；葛根素平均回收率(n=6)，分別為100.06%、100.04%、99.1%、99.4%、99.4%、100.08%，RSD為0.89%。結論 通過HPLC對葛根素含量測定的結果表明，所檢樣品符合規(guī)定。應用上述色譜法方便且準確，適用于通脈止渴膠囊中葛根素的含量測定與質量評價。

葛根素；HPLC法；通脈止渴膠囊

通脈止渴膠囊為處方藥，處方中有十四味藥材，葛根素為方中君藥，制劑中含量較高。經文獻及藥典檢索，葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經活絡、解酒毒等作用[1]。中醫(yī)臨床可用于治療外感發(fā)熱頭痛，項背強痛，口渴，消渴，麻疹不透，熱疾，泄瀉，眩暈頭痛，中風偏癱，胸壁心痛，酒毒傷中[2]。葛根具有有效的HPLC指標控制成分及方法且常作為中成藥物的質控標準，采用HPLC法測定葛根素含量，以利產品質量控制和臨床用藥的安全有效。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(型號：島津LC-20AT SPD-20AT，生產廠家：日本島津)；電子分析天平(型號：XS205DU，梅特勒-托利多(上海)；紫外可見分光光度計(型號：島津UV-2700，生產廠家：日本島津)；數控超聲波清洗器(型號：KQ-300DE型，生產廠家：昆山市超聲儀器有限公司)；臺式電熱干燥箱(型號：202-00AB型，生產廠家：天津市泰斯特儀器有限公司)；純水儀(生產廠家：MILLIPORE)。

1.2 試劑 葛根素(批號：110752-201313，含量：95.5%，中國藥品生物制品檢定院)；水：超純水(自制)；甲醇：色譜純 (默克)分析純(國藥集團)；磷酸(國藥集團)；通脈止渴膠囊(某市中醫(yī)醫(yī)院)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備[3]

2.1.1 供試品溶液 取膠囊內容物，研細后，精密稱取1 g置具塞錐形瓶中，加入50 ml的70%甲醇溶液，密塞并稱其重量，超聲0.5 h后放置至室溫，加70%甲醇適量補至原來重量，搖勻后過濾，精密量取3ml續(xù)濾液，置10ml容量瓶中，再加70%甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取葛根素對照品適量，加入甲醇制成36.86 μg/ml的溶液，既得。

2.2 色譜條件[4-5]色譜柱：Synergi4u Hydro-RP80A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75；流速：1.0 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。

按照上述方法，對樣品及葛根素對照品進行測定，樣品中葛根素峰分離度較好，色譜見圖1。

圖1 通脈止渴膠囊色譜(a為樣品，b為對照品)

2.3 方法學考察

2.3.1 流動相的篩選 由于本品是由葛根、當歸、川穹、地龍、蜈蚣、黃芪等十四味中藥構成的復方制劑，流動相考察實驗以方中葛根的質控成分葛根素為對象進行優(yōu)化。參照藥典[6]及相關文獻[7-8]以葛根素分離度、保留時間、對稱因子、理論塔板數等進行篩選。其中序號1為甲醇∶水=25∶75；序號2為甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75。結果見表1。

表1 流動相考察實驗結果

實驗結果顯示：序號1出峰時間較長，檢測時間相對較久，且峰拖尾較嚴重，序號2的出峰時間快，分離度較好，主峰無拖尾現象，可以滿足檢測要求，因此選擇甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75為流動相，并在此基礎上進行研究。

2.3.2 專屬性試驗 分別精密吸取葛根對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀進行測定。結果供試品色譜中，在與對照品色譜保留時間的相同位置上，有相應色譜峰，而陰性對照色譜中無相應色譜峰。說明處方中其他藥味對其含量測定并無干擾。

2.3.3 耐用性試驗 按照上述所定流動相為基礎，將測定條件進行少許變動，再對樣品進行測定，計算含量。對主要變動的色譜條件包括檢測波長及不同色譜柱進行了考察，以含量為依據，考察耐用性。結果見表2-3。

表2 耐用性-不同波長考察

表3 耐用性-不同色譜柱考察

結果表明：采用測定條件微小波動后的參數對樣品進行測定，結果在不同檢測波長下和色譜柱條件下測定結果RSD分別為：0.0955，0.0186。表明本方法耐用性良好。

2.3.4 線性范圍考察 精密量取對照品儲備溶液0.5 ml、1 ml、2.5 ml、5 ml、7.5 ml，均用甲醇稀釋至50 ml。分別量取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(A)對進樣質量(M，μg)進行線性回歸，回歸方程為：y=3918x+9956.5,相關系數R=0.99538，結果表明葛根素溶液在0.0369～0.5529 μg之間呈良好的線性。結果見圖2。

圖2 葛根素標準曲線

2.3.5 儀器精密度試驗 精密量取4項下對照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算儀器精密度，RSD=0.0015。試驗結果顯示儀器精密度良好。

2.3.6 樣品穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于3、4、5、6、7、8小時，精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，RSD=0.1755，表明供試品溶液在8 h之內穩(wěn)定性良好，能夠滿足測定需要，表明供試品溶液在8 h內基本穩(wěn)定。

2.3.7 方法重復性試驗 取同一批樣品(批號：150415)，平行取6份。按照上述擬定的葛根素含量測定方法，制備供試品溶液。精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算葛根素的含量。結果表明，此方法測定本品中葛根素的含量，RSD=0.8289%<2%，含量測定方法的重復性良好。結果見表4。

表4 重復性實驗考察

2.3.8 加樣回收率試驗 取本品內容物適量，研細，平行取6份樣品，約0.5 g，精密稱定后，置錐形瓶中，精密加入葛根素對照品儲備液5 ml、70%甲醇45 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)0.5 h，放至室溫，加70%甲醇補至原來重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3 ml于10 ml容量瓶中，加入70%甲醇溶液定容至刻度，即得供試品溶液。取葛根素對照品適量，精密稱定18.43 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得葛根素對照品儲備液。取4項下對照品溶液即得(36.86 μl/ml)。精密量取上述溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀進行測定。結果見表5。

表5 回收率實驗考察結果

表5結果顯示：RSD=0.89%，表明此方法測定本品中葛根素的含量，加樣回收率良好。

2.3.9 樣品測定 方法學考察結果提示：該測定方法可以作為本品的含量測定方法，準確可行，且操作簡便。連續(xù)6批本品按供試品溶液方法制備樣品溶液，分別精密量取樣品溶液10 μl，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，計算葛根素的含量。結果見表6。

表6 樣品含量測定結果

結果表明：藥材的質量、生產條件等因素一致的條件下，樣品的質量穩(wěn)定。

3 結 論

在本實驗各項條件下，對照品及樣品中組分均能達到基線分離，其分離度大于1.5，并且峰型良好。用70%的甲醇溶液做為提取溶劑，以甲醇—0.1%磷酸溶液為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長250 nm，柱溫25 ℃。建立的HPLC法測定通脈止渴膠囊中葛根素含量的方法，經方法學考察，達到藥物檢測要求。所以應用上述方法，具有簡便，更為準確高效的特點，適用于中藥處方通脈止渴膠囊中葛根素的含量測定與質量評價。

[1] 潘麗麗,江帆.高效液相色譜法測定保健食品葛枳膠囊中葛根素的含量[J].貴州師范大學學報,2012,30(2):71.

[2] 趙永良,王 超,韓亞朋.中藥現代化研究關鍵問題與前景[J].中醫(yī)中藥,2011,9(4):124.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2005版.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:233-234.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010版.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:272.

[5] 嚴軍,胡靜,陳啟蒙.高效液相色譜法測定注射用葛根素中葛根素含量[J].天津藥學,2008,20(4):27-28.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010版.二部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:1185-1186.

[7] 李靜,錢江.HPLC法同時測定復方黃連素片中芍藥苷和鹽酸小檗堿含量[J].中國藥業(yè),2016,25(7):61-62.

[8] 汪秋蘭,王文清,馬永貴.HPLC法在中藥有效成分含量測定中的應用[J].醫(yī)學導報,2011,30(11):1475.

HPLC method for content determination of puerarin from Pueraria lobata (wild) ohwi. of Tongmaizhike capsule

DENG Xin-xin ZHANG Yao-yao YU Li-na ZHU Xia-lin XUE Xiao-ting ZHAO Ying*

(Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Objective：To establish a HPLC method for content determination of puerarin from Pueraria lobata (wild) ohwi. of Tongmaizhike capsule. Methods：HPLC method was adopted to measure the contents of puerarin in Tongmaizhike capsule. A gilent Synergi4u Hydro-RP80AC18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm) was used. The mobile phase was methanol-1% phosphate (25∶75) with a flow rate of 1.0 ml/min, the UV detection wavelength was 250 nm and the column temperature was 25 ℃. Results: HPLC method for determination: The linear ranges of puerarin solution were 0.0369～0.5529μg/ml, the average recoveries (n=6) of puerarin were 100.06%,100.04%, 99.1%, 99.4%, 99.4% and 100.08%. RSD was 0.89%. Conclusion: The results show that the testing samples in accordance with the regulations and the applications of the chromatographic method are convenient and accurate, and suitable for the contents determination and quality evaluation of puerarin in Tongmaizhike capsule.

Puerarin; HPLC; Tongmaizhike capsule

泰山醫(yī)學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510439084)。

鄧欣鑫(1993—)，女，山東濰坊人，泰山醫(yī)學院在讀本科。

趙瑩，女，講師，主要從事藥物化學教學和研究工作。

R927

A

1004-7115(2017)05-0537-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.05.021

2016-12-17)