廖琳琳, 肖 順, 劉國坤, 張紹升

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

溫度對短尾根腐線蟲繁殖力的影響及其胚胎發(fā)育過程

廖琳琳, 肖 順, 劉國坤, 張紹升

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

在福建省花生種植區(qū)發(fā)現(xiàn)短尾根腐線蟲的侵害.采用胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)線蟲，觀察溫度對線蟲繁殖力的影響以及線蟲在最適溫度下的胚胎發(fā)育過程.研究表明，短尾根腐線蟲繁殖的適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度為30 ℃.30 ℃下短尾根腐線蟲從產(chǎn)卵至2齡幼蟲孵化需要8～9 d.

溫度; 短尾根腐線蟲; 繁殖力; 胚胎發(fā)育

近年來，福建省發(fā)現(xiàn)由咖啡根腐線蟲(Pratylenchuscoffeae)和短尾根腐線蟲(P.brachyurus)侵染引起的花生根腐線蟲病[1-2].花生受根腐線蟲侵染后，地上部植株發(fā)育不良，萎蔫變黃，地下部根系和莢果質(zhì)量減小，果莢上形成黑色斑，嚴(yán)重時果莢腐爛，造成花生產(chǎn)量和品質(zhì)下降.

短尾根腐線蟲是福建省花生上的優(yōu)勢種群，分布于福建省多個花生產(chǎn)區(qū).該線蟲能侵染花生根、果針、莢果及種皮，接種實驗證明其對花生有極強(qiáng)的致病性[2].我國學(xué)者對該線蟲的研究主要集中在病原鑒定和致病性測定方面[2-5]，有關(guān)其胚胎發(fā)育及溫度對其繁殖的影響情況等生物學(xué)特性方面的研究較少.因此，本文研究溫度對短尾根腐線蟲繁殖力的影響及其胚胎發(fā)育過程，以期為該病害的預(yù)測和防控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試線蟲樣本

線蟲標(biāo)本采自福建省廈門市翔安區(qū)的花生莢果，經(jīng)純化培養(yǎng)和鑒定，確認(rèn)為短尾根腐線蟲.線蟲樣本保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物線蟲學(xué)研究室.

1.2 溫度對線蟲繁殖力影響的測定

1.2.1 線蟲培養(yǎng) 采用胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)法[6].將經(jīng)0.2%氯霉素表面消毒30 min后的30條線蟲(幼蟲∶雌蟲=4∶1)接入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)的單片胡蘿卜愈傷組織中，培養(yǎng)皿蓋用保鮮膜封固.用記號筆標(biāo)明接種時間和溫度處理，置于15、20、25、30和35 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)60 d，每個培養(yǎng)溫度重復(fù)5皿.

1.2.2 觀察計數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后，取出胡蘿卜愈傷組織片,用解剖刀將其切成碎片，并倒入小燒杯中，加清水至沒過碎片，用玻棒攪拌1 min后浸泡24 h.用1號線蟲篩(孔徑2 000 μm)過濾并將濾液倒入培養(yǎng)皿，在解剖鏡下計數(shù)卵、幼蟲和成蟲數(shù)，統(tǒng)計不同溫度下培養(yǎng)的線蟲數(shù)量.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 繁殖率/%=(最終蟲量-初始蟲量)×100/初始蟲量，采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較.

1.3 線蟲胚胎發(fā)育過程的觀察

取出一片繁殖短尾根腐線蟲的胡蘿卜愈傷組織片，搗碎分離，將懷卵的雌蟲挑入單凹玻片的水滴中產(chǎn)卵.產(chǎn)卵后，立即將單胞卵轉(zhuǎn)移至另一凹玻片的水滴中，一個凹槽放置一個單胞卵，共9個重復(fù)，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗、保濕培養(yǎng).每12 h取出一次，在光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄胚胎發(fā)育過程.

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對線蟲繁殖力的影響

表1顯示，在15～30 ℃，隨著溫度的升高，線蟲卵量、幼蟲量、成蟲量、總量和繁殖率均不斷升高.在30 ℃下，卵量、幼蟲量、成蟲量、總量和繁殖率均達(dá)到最高值，該溫度下線蟲的繁殖率與15、20、35 ℃下的繁殖率具有顯著差異；15、20、35 ℃下的繁殖率沒有顯著差異.因此，短尾根腐線蟲產(chǎn)卵和繁殖的適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度為30 ℃.

表1 溫度對短尾根腐線蟲繁殖力的影響1)Table 1 Effect of temperature on reproduction capacity of P.brachyurus

1)數(shù)據(jù)為5個重復(fù)的平均值；同列數(shù)據(jù)后的小寫字母表示在P=0.05顯著性水平下的多重比較，字母相同者表示差異不顯著，反之則差異顯著.

2.2 最適溫度下線蟲的胚胎發(fā)育過程

短尾根腐線蟲的卵為長橢圓形，表面光滑，平均大小為70.2(58.7～81.7) μm×29.4(24.5～37.1) μm.卵由外殼、卵黃膜和原生質(zhì)等部分組成.

剛產(chǎn)的卵為單細(xì)胞，有球狀顆粒布滿卵腔(圖1A).在30 ℃下，第1次卵裂發(fā)生在0.5 d內(nèi)，方向與卵長軸垂直，中間出現(xiàn)一條界線，將單細(xì)胞隔開形成雙細(xì)胞(圖1B).之后，依細(xì)胞分裂快慢而異，形成3～5個細(xì)胞.1 d后形成4～10個細(xì)胞，1.5 d形成8～18個細(xì)胞(圖1C).2 d后分裂加快，逐漸發(fā)育形成20個以上的多細(xì)胞，稱之為桑葚期卵.3 d后，一部分發(fā)育較快的卵已進(jìn)入囊胚期，其特點是有大、小細(xì)胞分化，小細(xì)胞群緊貼于卵黃膜形成外胚層，中間大細(xì)胞形成內(nèi)胚層(圖1D).3.5 d后卵進(jìn)入原腸期，逐漸形成深淺不同的2種顏色細(xì)胞(圖1E).4.5 d后卵發(fā)育進(jìn)入蝌蚪期至蠕蟲期，蝌蚪期卵的一側(cè)細(xì)胞顏色較深，將形成線蟲的尾，另一側(cè)細(xì)胞顏色較淺，將形成線蟲的其他部位；蠕蟲期的卵形成2折結(jié)構(gòu)(圖1F).5 d后部分卵進(jìn)入4折結(jié)構(gòu)的1齡幼蟲階段，尚未分化形成口針和中食道球(圖1G).6.5 d后所有卵處于1齡幼蟲階段.7 d后部分幼蟲完成第1次脫皮，進(jìn)入各個器官分化完整的2齡幼蟲階段，該階段線蟲口針強(qiáng)壯，有明顯的基部球和中食道球(圖1H).8 d后部分2齡幼蟲破卵孵出，于水中自由蠕動.9 d后，所有2齡幼蟲均從卵中成功孵出.由此可見，從卵產(chǎn)出至2齡幼蟲孵出所需的時間為8～9 d(表2).

3 討論

本研究表明，短尾根腐線蟲繁殖的適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度為30 ℃.該結(jié)果與Fourie et al[7]的研究一致.短尾根腐線蟲卵的發(fā)育過程經(jīng)歷單胞期至多次分裂的多胞期，再進(jìn)入囊胚期、原腸期、蝌蚪期、蠕蟲期和1齡幼蟲期，最后進(jìn)入2齡幼蟲期后孵化.這種胚胎發(fā)育模式與索恩根腐線蟲(P.thornei)[8]和斯克里布納根腐線蟲(P.scribneri)[9]的分裂模式一致.30 ℃下，從卵產(chǎn)出至2齡幼蟲孵出所需的時間為8～9 d.

A：單胞；B：雙胞；C：多胞；D：囊胚期；E：原腸期；F：蠕蟲期；G：1齡幼蟲；H：2齡幼蟲.圖1 短尾根腐線蟲胚胎發(fā)育各個時期Fig.1 Different stages of embryonic development of P.brachyurus

表2 短尾根腐線蟲的胚胎發(fā)育過程Table 2 Embryonic development of P.brachyurus

花生原產(chǎn)于熱帶，較高的溫度條件有利于其生長發(fā)育.福建春花生從播種到收獲的時間為3月上旬—7月中旬，秋花生為8月上旬—12月中旬.可見，花生生長期大部分處于較高的溫度；而短尾根腐線蟲又是一種喜高溫線蟲，在這種溫度下線蟲可以完成多個生活史，并對花生造成嚴(yán)重侵染和危害.該線蟲現(xiàn)已在廈門、寧德等地發(fā)生危害，有關(guān)部門應(yīng)予以高度重視，積極采取有效措施，以防止其大面積傳播擴(kuò)散.

[1] 廖琳琳,章淑玲,肖順,等.寄生于花生的根腐線蟲種類鑒定及致病性測定[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015,44(3):240-244.

[2] 章淑玲,廖琳琳,劉國坤,等.花生短體線蟲病的病原鑒定與診斷[J].熱帶作物學(xué)報,2015,36(2):365-370.

[3] 楊意伯,張紹升.番石榴根部短尾根腐線蟲的鑒定[J].熱帶作物學(xué)報,2013,34(8):1557-1563.

[4] 章淑玲,王宏毅,金亮.寄生臺灣春蘭的短體線蟲種類鑒定[J].熱帶作物學(xué)報,2013,34(12):2463-2466．

[5] 趙立榮,崔汝強(qiáng),王金成,等.從尼日利亞進(jìn)境的芋頭中截獲最短尾短體線蟲[J].植物檢疫,2011,25(4):35-38．

[6] 張紹升.植物線蟲病害診斷與治理[M].福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社,1999.

[7] FOURIE H, VENTER G A, MC DONALD A H. Optimum temperature and inoculation levels for in vitro production ofPratylenchusbrachyuruson carrot discs[J]. South African Journal of Plant and Soil, 2003,20(1):44-45.

[8] CASTILLO P, TRAPERO-CASAS J L, JIMéNEZ-DAZ R M. The effect of temperature on hatching and penetration of chickpea roots byPratylenchusthornei[J]. Plant Pathology, 1996,45：310-315.

[9] ROMAN J, HIRSCHMANN H. Morphology and morphometrics of six species ofPratylenchus[J]. Journal of Nematology, 1969,1(4):363-368.

(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Influence of temperature on reproductive capacity ofPratylenchusbrachyurusand its embryonic development

LIAO Linlin, XIAO Shun, LIU Guokun, ZHANG Shaosheng

(College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Pratylenchusbrachyuruswas detected from the peanut production areas of Fujian Province. The nematodes were cultured on carrot callus tissues, and the effect of temperature on reproductive capacity and morphological changes during embryonic development under optimum temperature were recorded. The results showed that the suitable temperature range for nematode production was 25-30 ℃ with the optimal temperature being 30 ℃. And it took 8-9 d for eggs to reach 2 instar larvae when hatched at 30 ℃.

temperature;Pratylenchusbrachyurus; reproductive capacity; embryonic development

2016-10-12

2016-11-07

國家自然科學(xué)基金(31201495).

廖琳琳(1989-)，女，助理實驗師.研究方向：植物病理學(xué).Email:liaolinlin100@126.com.通訊作者張紹升(1951-)，男，教授.研究方向：植物病理學(xué)和植物線蟲學(xué).Email:shaoshengzhang@126.com.

S432.4

A

1671-5470(2017)03-0247-03

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.002