劉夢茜, 李春燕, 陳仕怡, 袁曉琴, 星 東, 王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

豬流行性腹瀉病毒M蛋白的原核表達(dá)

劉夢茜, 李春燕, 陳仕怡, 袁曉琴, 星 東, 王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了M基因的特異性引物，擴(kuò)增了M基因，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，優(yōu)化了異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)條件.結(jié)果表明，重組表達(dá)的融合蛋白Pet-32a-M大小約為43 ku，與預(yù)期大小相符.十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測表明，M蛋白為包涵體蛋白，且在IPTG濃度為0.8 mmol·L-1，溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h的條件下，蛋白表達(dá)效果最佳.蛋白免疫印跡檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，重組蛋白Pet-32a-M在體外可以被成功表達(dá).

豬流行性腹瀉病毒; M蛋白; 原核表達(dá)

豬流行性腹瀉是由流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染所引起的一種死亡率較高的腸道傳染性疾病，以食欲下降、嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀[1].臨床研究表明，豬流行性腹瀉對(duì)未斷奶仔豬的危害較大，其感染率可達(dá)100%[2-3]，給我國的養(yǎng)豬業(yè)及養(yǎng)殖戶帶來了很大影響.目前對(duì)豬流行性腹瀉無有效的藥物進(jìn)行治療[4]，研制并應(yīng)用基因工程疫苗是預(yù)防該病較為重要的途徑.

本試驗(yàn)對(duì)分離到的PEDV毒株進(jìn)行測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該P(yáng)EDV毒株為經(jīng)典毒株，與經(jīng)典毒株的同源性達(dá)到98%.PEDV屬冠狀病毒屬，有5個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白.PEDV S蛋白是病毒粒子表面的纖突蛋白，主要參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，并能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[5].但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，S蛋白在受到宿主免疫選擇的壓力下易發(fā)生變異，導(dǎo)致宿主范圍和毒力發(fā)生改變[6].相關(guān)文獻(xiàn)表明，2010年在我國已免疫豬群中爆發(fā)的豬流行性腹瀉是由變異的PEDV毒株引發(fā)的，且變異主要集中在S蛋白[7].因此，PEDV-S基因的變異可能是導(dǎo)致豬PEDV疫苗免疫效果不佳的原因.

M蛋白是PEDV另一主要結(jié)構(gòu)蛋白，是冠狀病毒外膜最主要的成分,它的一級(jí)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诓《镜难b配極為重要[8].M蛋白為跨膜蛋白，較為保守，能誘導(dǎo)宿主α-干擾素的表達(dá)，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[9]，在補(bǔ)體存在的條件下可中和病毒[10-11].因此，M蛋白可作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原.但大量研究表明，M蛋白在體外較難表達(dá)，出現(xiàn)表達(dá)量低或不表達(dá)的情況.高慎陽等[12]對(duì)M蛋白的體外表達(dá)進(jìn)行了嘗試，但僅表達(dá)出其膜外區(qū)；另外，吳凌等[13]構(gòu)建了Pet-30a原核表達(dá)載體,并在不同的宿主細(xì)胞中反復(fù)嘗試誘導(dǎo)表達(dá),但均未獲得成功.盡管在很多文獻(xiàn)中都有涉及M蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建，但在誘導(dǎo)表達(dá)的過程中缺乏細(xì)致的誘導(dǎo)條件的摸索，這可能會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)量低或不表達(dá).可見，M蛋白體外的高度表達(dá)還存在一定的問題，為提高M(jìn)蛋白的體外表達(dá)，本試驗(yàn)研究能夠有效穩(wěn)定表達(dá)PEDV M蛋白的方法和體系，并通過優(yōu)化條件提高M(jìn)蛋白的表達(dá)量.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及表達(dá)載體 PEDV FJ-Fuzhou毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；表達(dá)載體為Pet-32a(+)(Promega北京生物技術(shù)有限公司)；DH-5α和EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自Promega北京生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 試劑與儀器 病毒RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司；BamHⅠ和SalⅠ快切限制酶、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒購自博士德生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(10～120 ku)和超級(jí)ECL發(fā)光試劑盒購自賽默飛世爾科技公司.

主要儀器有DL777型PCR儀(北京東林生物技術(shù)公司)、DYY16D電泳儀(北京六一生物技術(shù)有限公司)、Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司).

1.2 病毒RNA的提取

將本實(shí)驗(yàn)室保存的病毒液進(jìn)行病毒RNA的提取，置冰箱(-80 ℃)保存.

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中已上傳的PEDV M蛋白基因序列(KX253991.1)，采用DNAStar軟件設(shè)計(jì)特異性引物(酶切位點(diǎn)為標(biāo)有下劃線的堿基序列)：上游引物——CGGGATCCATGTCTAACGGTTCTATTCC(BamHⅠ)；下游引物——GCGTCGACTTAGACTAAATGAAGCACT(SalⅠ).將加有酶切位點(diǎn)的引物送至合成，擴(kuò)增697 bp的M蛋白基因片段.

1.4 目的基因的PCR擴(kuò)增

將低溫保存的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得目的基因片段.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，將697 bp的目的基因片段條帶膠回收純化.

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

純化的目的片段產(chǎn)物和Pet-32a質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后于4 ℃連接，轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行涂板(加有氨芐的LB培養(yǎng)板)，第2天挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的質(zhì)粒送至測序.

1.6 重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)

將Pet-32a-M重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，挑取轉(zhuǎn)化后過夜培養(yǎng)的白色單克隆菌落接種于1 mL的加有氨芐的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大菌量，并用分光光度計(jì)檢測菌液濃度.當(dāng)D600 nm=1.0時(shí)，取出等量的兩份菌液，一份加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG蛋白誘導(dǎo)劑進(jìn)行處理，另一份則取等量的PBS作為對(duì)照，同時(shí)設(shè)置E.coliBL21(DE3)空白菌誘導(dǎo)組和轉(zhuǎn)入Pet-32a(+)的空載體菌誘導(dǎo)組作為對(duì)照.將4組菌液置于相同的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測.

1.7 Pet-32a-M蛋白誘導(dǎo)表達(dá)體系的優(yōu)化

1.7.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 保存的陽性克隆菌復(fù)蘇后，按照1∶100的比例接種于加有氨芐的LB培養(yǎng)基，置250 r·min-1、37 ℃的搖床中，分別加入不同梯度終濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol·L-1)的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，各組誘導(dǎo)時(shí)間和溫度保持一致，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測，最終確定最佳的誘導(dǎo)濃度.

1.7.2 IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 在確定的最佳誘導(dǎo)濃度下，其他培養(yǎng)條件不變，分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、6、8和10 h)取樣進(jìn)行蛋白變性，接著各取20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)間.

1.7.3 IPTG最佳誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 在確定的最佳誘導(dǎo)濃度和時(shí)間下對(duì)菌液進(jìn)行誘導(dǎo)，并分別置于不同梯度的溫度(25、28、31、34、37和40 ℃)下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白變性后，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，以確定最佳的誘導(dǎo)溫度.

1.8 重組M蛋白的蛋白免疫印跡檢測

變性的重組蛋白32a-M經(jīng)SDS-PAGE分離后，采用轉(zhuǎn)印槽進(jìn)行免疫印跡，隨后采用一抗和二抗進(jìn)行免疫雜交，并用ECL顯色液進(jìn)行曝光.

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV-M基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1：M基因擴(kuò)增產(chǎn)物.圖1 M基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplified M gene

將PEDV FJ-Fuzhou毒株的基因組作為模板，以M基因的上、下游引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到一條大小約為697 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期的片段大小相符.表明該引物對(duì)PEDV FJ-Fuzhou毒株M基因片段的擴(kuò)增具有特異性，并得到PEDV FJ-Fuzhou毒株M基因序列.

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

挑選白色單克隆菌為模板，分別用M基因上、下游引物，M基因上游引物和T7下游引物，目的基因下游引物和T7上游引物，T7上、下游引物對(duì)陽性克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定.結(jié)果(圖2)顯示，分別在697、805、1 272和1 380 bp處得到相應(yīng)的目的條帶.PCR鑒定后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定.結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)入目的片段的重組質(zhì)粒相對(duì)于空質(zhì)粒的位置較高，且雙酶切后分離出大小約為697 bp的片段，與預(yù)期片段的大小一致.鑒定結(jié)果表明，PEDV M蛋白已成功克隆至Pet-32a載體中.測序結(jié)果進(jìn)一步表明，重組質(zhì)粒(Pet-32a-M)成功構(gòu)建，無移碼錯(cuò)誤.

M:2 000 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1：M基因上、下游引物的擴(kuò)增產(chǎn)物;2:M基因上游引物、T7下游引物的擴(kuò)增產(chǎn)物;3:M基因下游引物、T7上游引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；4:M基因上、下游引物的擴(kuò)增產(chǎn)物.圖2 PCR鑒定電泳圖Fig.2 Identification of M gene via electrophoretogram

圖3 PCR酶切鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoresis identification of pET-32a-M by restriction enzyme digestion

2.3 誘導(dǎo)的Pet-32a-M蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果

由Pet-32a(+)表達(dá)載體圖譜可見，載體自身可表達(dá)多個(gè)標(biāo)簽多肽蛋白，整個(gè)融合多肽大小約為20 ku.通過DNAMAN軟件分析可知，M蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量約為23.6 ku，因此，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)出的預(yù)期目的蛋白大小約為43.6 ku.取誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒菌離心，分別取上清和沉淀變性，SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖4A)顯示，在沉淀中出現(xiàn)與預(yù)期大小相同的蛋白，而在空質(zhì)粒菌和上清中未出現(xiàn)，表明該蛋白為包涵體蛋白.接著取Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌沉淀，在IPTG誘導(dǎo)的條件下，可明顯表達(dá)出大小約為43 ku的特異性條帶，同樣條件誘導(dǎo)下的空白菌和Pet-32a空載體菌均未出現(xiàn)該特異性條帶(圖4B).同時(shí)對(duì)比未誘導(dǎo)的Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌和誘導(dǎo)后的Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌，可見誘導(dǎo)后的重組菌出現(xiàn)的特異性條帶的亮度明顯大于未誘導(dǎo)的重組菌.此外，Pet-32a(+)空載體菌誘導(dǎo)組與空白菌相比，可見一條大小約為20 ku的條帶，這也與預(yù)期的空載體標(biāo)簽蛋白大小相符.

A：可溶性的重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物(M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白誘導(dǎo)組；2:上清；3:沉淀);B：IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物(M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白誘導(dǎo)組；2：空載體菌誘導(dǎo)組；3:重組質(zhì)粒菌未誘導(dǎo)組；4:重組質(zhì)粒菌誘導(dǎo)組).圖4 E.coli BL21(DE3)中重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in E.coli BL21 (DE3)

2.4 32a-M誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 在37 ℃下，用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖5)顯示：IPTG終濃度為0～0.6 mmol·L-1時(shí)，蛋白條帶較暗且變化不大；IPTG終濃度為0.8～1.5 mmol·L-1時(shí)，蛋白條帶的亮度有所增大，且在0.8 mmol·L-1時(shí)最亮.可見，Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌在IPTG終濃度為0.8 mmol·L-1時(shí)的表達(dá)量最大.

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～8：IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌組；9：空白誘導(dǎo)組.圖5 重組蛋白誘導(dǎo)濃度優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of the induced recombinant protein under the optimum IPTG concentration by SDS-PAGE

2.4.2 IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 在IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，溫度為37 ℃的條件下，檢測Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌在0、2、4、6、8和10 h的表達(dá)情況.SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖6)顯示：誘導(dǎo)0和2 h時(shí)，蛋白條帶較暗；誘導(dǎo)4 h時(shí)，蛋白條帶的亮度明顯增強(qiáng)，且在4～8 h時(shí)亮度逐漸遞增，在8 h時(shí)達(dá)到最亮.可見，在IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，溫度為37 ℃的條件下，Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌在誘導(dǎo)8 h時(shí)的表達(dá)量最大.

2.4.3 IPTG最佳誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 在IPTG終濃度為0.8 mmol·L-1，誘導(dǎo)8 h的條件下，檢測Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌在25、28、31、34、37和40 ℃下的表達(dá)情況.SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖7)顯示，37 ℃下誘導(dǎo)的蛋白條帶最亮.可見，37 ℃為最適誘導(dǎo)溫度.

2.5 32a-M蛋白的蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

為驗(yàn)證Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌誘導(dǎo)后是否是預(yù)期的目的蛋白并驗(yàn)證該蛋白是否具有活性，分別以His·Tag標(biāo)簽蛋白的抗體和PEDV陽性血清作為一抗，對(duì)誘導(dǎo)變性后的蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測.結(jié)果顯示，以His·Tag標(biāo)簽蛋白抗體作為一抗的重組質(zhì)粒菌組和空質(zhì)粒菌組分別在43和20 ku左右的位置出現(xiàn)了特異性條帶，而空白菌組未出現(xiàn)任何條帶(圖8A)，該結(jié)果可進(jìn)一步證明Pet-32a-M蛋白在體外成功表達(dá).采用PEDV陽性血清作為一抗的蛋白免疫印跡檢測結(jié)果(圖8B)表明，PEDV M蛋白的體外表達(dá)具有一定的抗原活性.

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白誘導(dǎo)組；2～7：分別為誘導(dǎo)0、2、4、6、8和10 h時(shí)的重組質(zhì)粒菌組.圖6 重組蛋白誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of the induced recombinant protein under the optimum expression time by SDS-PAGE

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白誘導(dǎo)組；2～7：分別在25、28、31、34、37和40 ℃下誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌組.圖7 重組蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 Electrophoretogram of the induced recombinant protein under the optimum temperature by SDS-PAGE

A:以His·Tag抗體為一抗(1：空質(zhì)粒菌組;2：重組質(zhì)粒菌組;3：空白菌組);B:以PEDV血清為一抗(1：陽性血清組;2：陰性血清組).圖8 蛋白免疫印跡檢測電泳圖Fig.8 Electrophoretogram of the recombinant Pet-32a-M by Western blot

3 討論

研究表明，冠狀病毒M蛋白表達(dá)較為困難，且不穩(wěn)定，少部分動(dòng)物(如豬、犬等)的M蛋白得到表達(dá)，但表達(dá)結(jié)果不理想，或表達(dá)不穩(wěn)定[14-15].張志榜[16]、Gao et al[17]通過將M蛋白基因設(shè)計(jì)為不同大小的片段并結(jié)合融合蛋白進(jìn)行原核表達(dá)的方法，能夠穩(wěn)定地將各個(gè)片段穩(wěn)定表達(dá)，但只有膜外區(qū)獲得了高度表達(dá)，且沒能表達(dá)出M蛋白全序列.有研究表明：M蛋白具有抑菌作用，能使細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此在表達(dá)過程中很難實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)，且表達(dá)不穩(wěn)定[18-19]；當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到一定量時(shí)，會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生一定的抑制作用，即對(duì)宿主產(chǎn)生毒性作用[20].但鄭芳園等[21]研究表明，通過對(duì)M蛋白的親水區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)并不會(huì)在表達(dá)過程中出現(xiàn)抑菌或?qū)е录?xì)菌死亡現(xiàn)象的發(fā)生.目前對(duì)于M蛋白是如何作用于細(xì)胞的機(jī)制尚不是很清楚，因此，為提高M(jìn)蛋白體外的表達(dá)量，本試驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并明確了M蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件.優(yōu)化結(jié)果表明，Pet-32a-M重組質(zhì)粒菌在37 ℃，IPTG終濃度為0.8 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h的條件下誘導(dǎo)，蛋白的表達(dá)量最高.

豬流行性腹瀉是一種高度接觸性腸道傳染病，不同種群和不同年齡階段的豬均易感，但對(duì)不同年齡階段豬的致死率有所差異，其中對(duì)仔豬的致死率最高.對(duì)豬的腹瀉病檢測顯示，流行性腹瀉病例占46%，其中，混合感染的病例占31%[22]，這表明流行性腹瀉在我國腹瀉性疾病中占主要地位.自20世紀(jì)80年代開始，PEDV在我國各地開始蔓延，并使用相應(yīng)的二聯(lián)苗和弱毒苗進(jìn)行免疫預(yù)防.近年來，PEDV疫苗的免疫效果漸漸不理想，經(jīng)典疫苗株CV777弱毒疫苗對(duì)變異株引起的流行性腹瀉的免疫效果不佳.通過對(duì)PEDV疫苗毒株的全基因組序列與我國臨床毒株的同源性比較發(fā)現(xiàn)，兩者存在較大的差異[23]；對(duì)變異毒株進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，S基因是PEDV變異最大的區(qū)域[24].變異株中S基因的突變或缺失都會(huì)使毒株之間的免疫原性存在較大的差異，導(dǎo)致疫苗免疫效果不佳.研究表明，M蛋白較為保守，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要結(jié)構(gòu)蛋白；同時(shí)，M蛋白能誘導(dǎo)宿主α-干擾素的表達(dá)，并能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，是作為PEDV基因工程疫苗較為理想的候選蛋白.因此，M蛋白體外的成功表達(dá)對(duì)該蛋白功能的探索以及基因工程疫苗的研發(fā)都具有重要的意義.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Prokaryotic expression of porcine epidemic diarrhea virus M protein

LIU Mengxi, LI Chunyan, CHEN Shiyi, YUAN Xiaoqin, XING Dong, WANG Quanxi

(College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To increase the expression level of M protein which is a candidate antigen for porcine epidemic diarrhea virus, specific primer forMgene was designed and amplified. The positive recombinant plasmid was identified and transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) competent cell, and followed by being induced by isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG). Then the inducible expression system was optimized in terms of IPTG concentration, expression time and temperature. Results showed that the recombinant protein was successfully expressed, with the molecular weight being about 43 ku. SDS-Polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) analysis indicated that M protein is an inclusion body protein. The optimal induction conditions were to add 0.8 mmol·L-1IPTG and be induced at 37 ℃ for 6 h. In addition, Western-blot contfirmed that the recombinant plasmid Pet-32a-M was transformed intoE.coliBL21 (DE3) competent cell and successfully expressedinvitro.

porcine epidemic diarrhea virus; membrane protein; procaryotic expression

2016-10-24

2016-12-31

福建農(nóng)林大學(xué)科學(xué)發(fā)展基金資助項(xiàng)目(KF2015094).

劉夢茜(1993-)，女，碩士.研究方向：動(dòng)物傳染病.Email:1241658150@qq.com.通訊作者王全溪(1978-)，男，副教授.研究方向：宿主與病原互作.Email:wqx608@126.com.

S852.65+1

A

1671-5470(2017)03-0299-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.011