倪 卓，楊 莎，吳耿峰，潘田光，劉 學(xué)，任英華，林佩芳，林澤宇

1)深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳518060；2)深圳市第六人民醫(yī)院口腔科，廣東深圳 518067

【化學(xué)與化工 / Chemistry and Chemical Engineering】

PES-HA生物復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性和生物毒性

倪 卓1，楊 莎1，吳耿峰1，潘田光1，劉 學(xué)2，任英華2，林佩芳1，林澤宇1

1)深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳518060；2)深圳市第六人民醫(yī)院口腔科，廣東深圳 518067

采用溶解超聲方法制備聚醚砜(polyethersulfone, PES)-羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)生物復(fù)合材料．紅外光譜顯示該復(fù)合材料主要為物理結(jié)合；熱重分析研究發(fā)現(xiàn)，該組復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性隨HA質(zhì)量分數(shù)的增加而增加，熱分解反應(yīng)級數(shù)均為1；細胞毒性測試發(fā)現(xiàn)，該組材料毒性級別均為Ⅰ級，對MG-63細胞無毒．加入HA的PES能夠使細胞在復(fù)合材料中相對增值率增大，改善細胞生物相容性；熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞在材料浸提液中生長良好，已貼壁的細胞形態(tài)為梭形或多角形，折光性強，存在明顯的細胞增殖．

生物材料；復(fù)合材料；聚醚砜；羥基磷灰石；熱穩(wěn)定性；分解動力學(xué)；細胞毒性

聚醚砜(polyethersulfone, PES)又稱聚苯醚砜或聚芳醚砜， 是用于工業(yè)制造領(lǐng)域的特種工程材料， 聚醚砜分子同時具有苯環(huán)的剛性和醚基的柔性． 砜基與整個結(jié)構(gòu)單元形成的大共軛體系，具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、機械性能和電性能，是具有高熱變形溫度、高沖擊強度和優(yōu)良成型性的特種工程塑料[1-2]．這種材料易成型，經(jīng)過高溫高壓或輻射消毒后材料力學(xué)性能不會劣化，符合醫(yī)療器械消毒要求[3-4]．盡管PES在生理環(huán)境中力學(xué)性能穩(wěn)定，但其生物活性有限，無法在骨替代材料領(lǐng)域直接使用[3]，因此，可考慮將其作為復(fù)合材料基體，加入納米羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)制成生物復(fù)合材料．nHA的微結(jié)構(gòu)類似天然骨基質(zhì)，可被骨組織直接利用．nHA分子和天然骨無機礦物質(zhì)大小相近，有利于人體細胞和大分子對該材料的識別，提高材料的生物活性和生物相容性.nHA的低結(jié)晶度和含碳酸根特征，具有與骨鍵合的能力，有利于提供適宜的環(huán)境促進礦物的沉積和骨細胞的黏附[5-6]．均勻分散于聚合物之中的納米羥基磷灰石能在單位體積內(nèi)產(chǎn)生超大的界面積，能使聚合物納米復(fù)合材料力學(xué)性能得到顯著提高，同時生物相容性也得到提高[7-8]．

本研究以N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl-formamide,DMF)為溶劑，制備聚醚砜溶液．采用超聲技術(shù)在聚醚砜溶液中分散納米羥基磷灰石，制備不同質(zhì)量比的PES-HA生物復(fù)合材料．采用熱重分析法(thermogravimetricanalysis,TG)研究升溫速率對熱重曲線的影響，分析熱分解動力學(xué)參數(shù)，可為該材料的理論研究和工程應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及設(shè)備

聚醚砜購自吉林大學(xué)湖南中試化工廠；納米羥基磷灰石(純度97%)購自南京埃普瑞納米材料有限公司；N, N-二甲基甲酰胺(DMF； 分析純500 mL)， 購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；MG-63成骨細胞購自上海生命科學(xué)院；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；小牛血清購自美國Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS) 購自美國Hyclone公司； 噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide, MTT)購自美國Sigma公司；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO) 購自美國Amresco公司．真空干燥箱和高壓滅菌鍋(HV-50)購自日本Hirayama公司；紅外光譜儀(Sectrum One Version B型)購自日本日立公司； 同步熱分析儀(STA409PC型)購自德國NETZSCH．

1.2 PES-HA復(fù)合材料的制備

以DMF為溶劑，加入nHA超聲處理至形成均勻的懸濁液；以DMF為溶劑，加入聚醚砜，緩慢加熱至聚合物充分溶脹，溶解成均一、穩(wěn)定、透明的溶液；將nHA懸濁液與聚醚砜溶液混合，冷凝回流并攪拌，150 ℃反應(yīng)2h后鑄膜；制得HA質(zhì)量分數(shù)分別為10%、20%和30%的PES-HA復(fù)合材料，記作復(fù)合材料A、B和C．

1.3 傅立葉紅外光譜測試

采用紅外光譜儀對PES-HA復(fù)合材料進行測試，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，掃描10次．

1.4 熱穩(wěn)定性分析測試

以Al2O3為參比物，采用同步熱分析儀對PES和3種PES-HA復(fù)合材料進行熱重分析，實驗在氮氣(流速為30 mL/min)氣氛中進行，測試范圍為300～800 ℃，分別以5、10、20和40 ℃/min的升溫速率對樣品進行掃描，記錄測量結(jié)果．

1.5 力學(xué)性能測試

參照GB/T 1447—2005標準[9]，將樣品制成Ⅱ型試樣形式，采用萬能電子拉力機，以5 mm/min速率啟動拉伸實驗．拉伸強度公式為

δ=F/(bd)

(1)

其中，δ為拉伸強度(單位：MPa)；F為試樣在拉伸至斷裂中受到的最大力(單位：N)；b和d分別為試樣寬度和厚度(單位：mm)．

1.6 細胞毒性檢測

將HA、PES和3種PES-HA復(fù)合材料進行高壓滅菌，用RPMI1640培養(yǎng)液制備材料浸提液．培養(yǎng)MG-63細胞生長至對數(shù)期，棄原培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次，胰蛋白酶消化貼壁細胞，用完全培養(yǎng)基配制成單個細胞懸液，細胞板計數(shù)，每孔2×104個接種在96孔板上(n=6)， 每孔體積200μL． 24h后細胞貼壁，換用材料浸提液分別連續(xù)培養(yǎng)1、2、3和4d后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，37 ℃孵箱中繼續(xù)孵育4h，棄上清液，每孔加入150μLDMSO，搖床震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解．選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光密度值D(490)， 并記錄結(jié)果．

2 結(jié)果與討論

2.1 PES-HA復(fù)合材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖1 HA、PES和PES-HA復(fù)合材料的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectroscopy of HA, PES and PES-HA composites

2.2 PES-HA復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性

PES-HA生物復(fù)合材料具備良好的熱穩(wěn)定性，在長期的機體環(huán)境及成型過程中能耐熱耐高溫．升溫速率為20 ℃/min時，PES-HA復(fù)合材料熱重曲線和熱失重相關(guān)數(shù)據(jù)如圖2和表1．聚醚砜外推起始分解溫度te≈521 ℃， 熱穩(wěn)定性能良好． 在PES-HA復(fù)合材料中，隨著w(HA)增加，其外推起始分解溫度會隨之升高，最大分解速率k、 最大分解速率對應(yīng)的溫度tm和最小剩余率wr也隨之增加．這些TG曲線均呈臺階式走向，具有分解起始拐點和結(jié)束拐點，至分解結(jié)束拐點后趨于平緩，在736 ℃時仍不能完全分解． 其中，PES的最小剩余率低，w(HA)高的PES-HA復(fù)合材料的PES最小剩余率高．

圖2 PES和PES-HA復(fù)合材料熱失重曲線Fig.2 TG curves of PES and PES-HA composites

樣 品te/℃k/min-1tm/℃wr/%tr/℃PES521.218.87554.043.11736.1復(fù)合材料A533.115.52568.854.84736.7復(fù)合材料B540.914.72563.164.04736.8復(fù)合材料C545.410.78569.869.24735.9

升溫速率對PES及PES-HA復(fù)合材料熱分解有重要影響．分別測量升溫速率為5、10、20和40 ℃/min時， PES及PES-HA復(fù)合材料在不同升溫速率下的熱失重數(shù)據(jù)見表2. 隨著升溫速率的提升，外推起始溫度和最大分解速率都不斷升高，最小剩余率基本保持不變，失重曲線向高溫區(qū)平移．熱分解過程不僅表現(xiàn)在臨界起始分解溫度，而且表現(xiàn)在預(yù)分解時間．加熱速率增加，不能提供足夠的預(yù)分解時間，熱分解呈滯后狀態(tài)，在熱分解曲線上表現(xiàn)為熱分解在較高溫區(qū)域進行．加熱速率較慢，反映的熱分解起始溫度在時間上的滯后性．升溫速率越快的熱分解反應(yīng)，會在短時間內(nèi)結(jié)束，表現(xiàn)為熱分解速率加快．

2.3 PES-HA復(fù)合材料熱分解動力學(xué)

反應(yīng)的動力學(xué)方程是由反應(yīng)機理決定的，根據(jù)反應(yīng)的熱分析動力學(xué)方程

dα/dt=k(1-α)n

(2)

其中， dα/dt為反應(yīng)速率；k為速率常數(shù)；α為熱分解率；n為反應(yīng)級數(shù)．

k隨溫度的變化規(guī)律可用Arrhenius方程[10]表示

其中，A為頻率因子(或稱指前因子)；E為反應(yīng)活化能；R為氣體常數(shù)；T為反應(yīng)時的絕對溫度．

用Kissinger法[12]求熱力學(xué)參數(shù)，由式(3)可得

i=1, 2, …, 4(或5和6)

(4)

其中，βi為升溫速率(一般為常數(shù))；Tpi為等壓條件下的絕對溫度．

表2 PES和PES-HA復(fù)合材料不同升溫速率的熱失重數(shù)據(jù)

(5)

根據(jù)表2數(shù)據(jù)、式(4)和式(5)可求得PES-HA復(fù)合材料熱分解力學(xué)參數(shù)，如表3．PES-HA復(fù)合材料熱分解反應(yīng)級數(shù)為1，不隨w(HA)變化而改變；當w(HA)增加時，復(fù)合材料活化能增加，熱穩(wěn)定性增加．

表3 PES-HA熱分解動力學(xué)參數(shù)

2.4 PES-HA復(fù)合材料力學(xué)性能

表4為PES和PES-HA復(fù)合材料力學(xué)性能．隨著w(HA)增加，PES-HA復(fù)合材料的斷裂伸長率和拉伸強度均降低，彈性模量增加．在該復(fù)合材料中，PES與HA為物理結(jié)合，納米HA顆粒分散在PES基體中．HA為分散相，PES為連續(xù)相，隨著w(HA)增加，PES鏈段間作用力減弱，其拉伸強度有所降低，w(HA)越高，這種鏈段間作用力減弱愈加明顯．當w(HA)=10%時，復(fù)合材料的拉伸強度為65MPa，彈性模量為1.48GPa，可達到一些承力較低的骨的力學(xué)條件，如松質(zhì)骨、頸骨和腰骨等[12-14]．

表4 PES和PES-HA復(fù)合材料力學(xué)性能

2.5 細胞毒性測試

細胞相對增殖率(relative growth rate, RGR)能夠反映細胞增殖活性，可由D(490, 樣品組)/D(490, 對照組)計得[15]. 毒性分級根據(jù)細胞相對增殖率大小取定一個范圍，一般相對增殖率越高，毒性分級越低．細胞毒性分級標準[16]為：RGR≥100%為0級，75%～99%為Ⅰ級，50%～74%為Ⅱ級，25%～49%為Ⅲ級，1%～24%為Ⅳ級，0為Ⅴ級．0級和Ⅰ級表示無細胞毒性；Ⅱ級需要結(jié)合細胞形態(tài)分析綜合評定；Ⅲ級以上表示有細胞毒性．本實驗中各組材料細胞毒性均為Ⅰ級，對細胞無毒性，見表5．由表5可見，樣品中HA的RGR相對最高，PES-HA復(fù)合材料的RGR高于PES，隨著HA質(zhì)量分數(shù)的增加，其RGR逐漸升高，毒性逐漸降低．

材料對細胞的毒性可以反映在對細胞形態(tài)的影響上，通過觀察細胞形態(tài)可直觀判斷材料毒性，正常MG-63細胞的形態(tài)多為梭形或多角形[17-18]．圖3為倒置顯微鏡下MG-63細胞在HA、PES和PES-HA復(fù)合材料環(huán)境培養(yǎng)2d后的生長形態(tài)．由圖3(a)可見，已貼壁的細胞形態(tài)折光性強，多為梭形和多角形，存在明顯活細胞增殖，無明顯壞死．圖3(b)顯示細胞大部分為梭形，少量細胞呈球形，細胞貼壁聚集生長，數(shù)目較多，與對照組接近，可見HA對細胞增殖抑制作用較小．圖3(c)細胞呈梭形或三角形，有少數(shù)球形細胞，細胞數(shù)目比HA少．圖3(d)細胞呈梭形或三角形、細胞密度相對較稀疏．與圖3(c)相比，圖3(e)細胞數(shù)目增多，貼壁生長，呈梭形，可見早期分裂的圓形細胞，說明復(fù)合材料B對細胞增殖作用比復(fù)合材料A強．圖3(f)大量細胞貼壁生長為正?；罴毎?，許多細胞首尾相連呈聚集狀態(tài)，與復(fù)合材料B相比細胞密度增加，說明復(fù)合材料C對細胞增殖作用強．因此，隨著HA質(zhì)量分數(shù)增加，PES-HA復(fù)合材料對細胞的增殖作用增強．

表5 各組材料的細胞毒性測試結(jié)果1)

1) 對照組1～4 d 的D(490)依次為0.498、 0.724、 0.821和0.912；n=6.

圖3 HA、PES和PES-HA復(fù)合材料對細胞形態(tài)的影響(放大倍數(shù)為400)Fig.3 HA, PES and PES-HA composite on cells morphology (magnification is 400)

結(jié) 語

PES-HA復(fù)合材料的紅外光譜包含了PES和HA的特征峰，與基體材料相比，PES-HA復(fù)合材料峰值沒有出現(xiàn)明顯的偏移或者新峰出現(xiàn)，表明PES和HA主要是物理結(jié)合，該組復(fù)合材料熱分解反應(yīng)級數(shù)均為1，反應(yīng)級數(shù)不隨w(HA)的變化而改變．隨著w(HA)增加，復(fù)合材料活化能增加，熱穩(wěn)定性增加，拉伸強度降低，斷裂伸長率降低，彈性模量增大．該組PES-HA復(fù)合材料對MG-63細胞無毒，毒性級別均為Ⅰ級．HA加入PES中可以改善細胞生物相容性，細胞生長良好，折光性強，存在明顯的細胞增殖，細胞形態(tài)為梭形或多角形．

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：新 谷】

2016-12-29；Accepted：2017-03-07

Professor Ni Zhuo. E-mail: royzhuoni@hotmail.com

Thermal stability and biotoxicity of PES-HA biocomposites

Ni Zhuo1, Yang Sha1, Wu Gengfeng1, Pan Tianguang1, Liu Xue2, Ren Yinghua2, Lin Peifang1, and Lin Zeyu1

1) College of Chemistry and Environmental Engineering，Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China2) Department of Stomatology, The Sixth People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518067, P.R.China

Polyethersulfone-hydroxyapatite (PES-HA) biocomposites were prepared by dissolving ultrasonic method. Infrared spectroscopy shows that the composites are mainly composed by physical bonding. The thermo gravimetric analysis indicates that the thermal stability of the composites increases with the increase of HA content and the thermal decomposition reaction order is about 1. Cytotoxicity test shows that the toxicity level of the material is gradeⅠ, and the composites have no toxicity to MG-63 cells. The addition of HA into PES results in a relative increase in the growth rate of cells for the composites, thus improving the cell biocompatibility. The cells grow well in the material extract, the adherent cells are spindle or polygonal, with strong refraction and obvious cell proliferation.

biological materials; composite materials; polyether sulfone; hydroxyapatite; thermal stability; decomposition kinetics; cytotoxicity

：Ni Zhuo, Yang Sha, Wu Gengfeng, et al. Thermal stability and biotoxicity of PES-HA biocomposites[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(3): 313-318.(in Chinese)

國家自然科學(xué)基金資助項目(51378315)；深圳市科技計劃資助項目(JCYJ20140411094009912)

倪 卓(1963—)，男，深圳大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師. 研究方向：生物材料和功能材料.E-mail：royzhuoni@hotmail.com

TB 332

A

10.3724/SP.J.1249.2017.03313

Foundation：National Natural Science Foundation of China (51378315); Shenzhen Science and Technology Research Foundation (JCYJ20140411094009912)

引 文：倪 卓，楊 莎，吳耿峰，等.PES-HA生物復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性和生物毒性[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2017，34(3)：313-318.