劉 偉，劉雙龍，陳丹妮，牛憨笨

深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室, 廣東深圳 518060

【光電工程 / Optoelectronic Engineering】

CARS顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率標(biāo)定

劉 偉，劉雙龍，陳丹妮，牛憨笨

深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室, 廣東深圳 518060

空間分辨率是衡量相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering，CARS)顯微成像系統(tǒng)性能的一個重要指標(biāo). 選擇直徑為110 nm的聚苯乙烯微球進(jìn)行三維成像，根據(jù)各個點的位置數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)形成的二維數(shù)組分別重構(gòu)了系統(tǒng)x-y平面和x-z平面的點擴(kuò)展函數(shù)，準(zhǔn)確測試了自行搭建的CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向空間分辨率約為484nm，軸向空間分辨率約為3.17μm．

光學(xué)工程；相干反斯托克斯拉曼散射；圖像重構(gòu)；點擴(kuò)展函數(shù)；空間分辨率；非線性光學(xué)；拉曼散射；信息光學(xué)

1965年， Terhune等[14]發(fā)現(xiàn)了CARS現(xiàn)象．1982年，Maker等[15]將該現(xiàn)象與光學(xué)顯微鏡結(jié)合起來發(fā)展了CARS顯微技術(shù)．1999年，謝曉亮課題組將CARS系統(tǒng)的激發(fā)光布局從非共線轉(zhuǎn)為共線，簡化了CARS顯微成像系統(tǒng)，此后該技術(shù)迎來了快速發(fā)展并逐步走向?qū)嵱肹16-17]．CARS顯微成像技術(shù)將單點分析擴(kuò)展到對一定空間范圍內(nèi)具有結(jié)構(gòu)的樣品研究．該技術(shù)依靠逐點掃描獲得圖像，通過聚焦光斑與樣品間的相對運動，將樣品上每個點的強度信息與位置信息一一對應(yīng)，可在無需標(biāo)記的前提下獲得反映分子某一特征化學(xué)鍵的空間分布信息，為人類提供了遠(yuǎn)超人眼所能看到的內(nèi)容，現(xiàn)已廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)對脂類和蛋白質(zhì)分子成像等領(lǐng)域．空間分辨率是衡量CARS成像系統(tǒng)性能的一個重要指標(biāo)[18]，本研究選取直徑為110 nm的聚苯乙烯微球進(jìn)行三維成像，重構(gòu)系統(tǒng)的點擴(kuò)展函數(shù)．根據(jù)點擴(kuò)展函數(shù)的半高全寬，獲得CARS顯微成像系統(tǒng)的三維空間分辨率．

1 CARS顯微成像系統(tǒng)搭建

CARS為非線性過程，當(dāng)中心頻率為ωL的泵浦光與中心頻率為ωS的斯托克斯光的頻率差恰好等于分子某一化學(xué)鍵的振動頻率ΩR時[19]，即ωL-ωS=ΩR， 共振激發(fā)產(chǎn)生頻率為ωA=ωP+ΩR的反斯托克斯信號，ωP為探測光中心頻率[20]，能級圖如圖1[21]．其中，g為振動基態(tài)；v為振動激發(fā)態(tài)．

圖1 CARS過程能級圖[21]Fig.1 Energy level diagram of CARS process[21]

CARS信號的產(chǎn)生至少需要兩束脈沖激光，其中一束既是泵浦光又是探測光[22-23]. 利用飛秒脈沖泵浦光學(xué)參量放大器(opticalparametricoscillator,OPO)作為波長調(diào)諧的關(guān)鍵裝置[24]．脈沖激光器產(chǎn)生的光束一分為二，一路作為CARS系統(tǒng)的斯托克斯光，另一路泵浦OPO產(chǎn)生兩束與泵浦光脈沖時序完全一致、波長可調(diào)諧的信號光與閑頻光， 通常只采用信號光作為CARS系統(tǒng)的泵浦光，與斯托克斯光共同激發(fā)樣品[25]．本研究采用美國Spectra-Physics公司的鈦寶石飛秒激光脈沖泵浦OPO．中心波長為820nm，重復(fù)頻率為80MHz的飛秒脈沖倍頻后(中心波長為410nm)作為OPO的泵浦源，產(chǎn)生的信號光波長范圍為490～750nm，作為CARS成像系統(tǒng)的泵浦光．泵浦光與斯托克斯光的脈沖序列同步，通過光學(xué)時間延遲線可使脈沖精確重合，并通過顯微物鏡聚焦后共同作用于樣品．

選擇具有結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯分子，泵浦光與斯托克斯光頻差滿足聚苯乙烯分子苯環(huán)內(nèi)碳原子間非對稱伸縮振動引起的1 603cm-1振動頻率，共振激發(fā)產(chǎn)生相應(yīng)波長的CARS信號．鈦寶石飛秒激光泵浦OPO尚未耗盡的部分，即中心波長為820nm的光作為斯托克斯光，調(diào)整OPO的信號光波長至724nm，并同時作為泵浦光與探測光，產(chǎn)生的CARS信號中心波長為648nm．飛秒激光光源的脈寬很窄，因此調(diào)節(jié)兩路脈沖精確重合的難度較大．本研究選擇由精密線性平臺和兩塊呈90°擺放的反射鏡組成的光學(xué)時間延遲線精確控制脈沖之間的延遲，控制精度可達(dá)7fs．同步后的兩束飛秒脈沖光經(jīng)特殊設(shè)計的雙色鏡合束后共線輸入顯微物鏡，并調(diào)整激發(fā)光光軸與物鏡中心軸重合，以此保證在相同激發(fā)光功率下能夠獲得最大的信號強度．激光束通過數(shù)值孔徑為0.95的消色差顯微物鏡聚焦到樣品上，信號只產(chǎn)生于光功率密度較高的焦點處，并具有良好的方向性，可通過一個數(shù)值孔徑為0.85的聚光鏡收集，并通過一根單模光纖輸入至光譜儀中，系統(tǒng)示意如圖2．

圖2 CARS顯微成像系統(tǒng)示意圖Fig.2 Diagram of the CARS microscopy system

CARS信號通過大數(shù)值孔徑聚光鏡收集后由光纖輸入至光譜儀．通過聚焦光斑與樣品之間的相對運動，對樣品進(jìn)行逐點掃描，通過軟件進(jìn)行圖像重構(gòu)后獲取一幅完整的CARS顯微圖像．聚焦光斑與樣品之間的相對運動由三維納米位移臺完成(型號為PI，P-545.3C7)，位移臺的移動與光譜儀的數(shù)據(jù)采集需緊密配合方能完成樣品掃描過程．掃描過程中，當(dāng)納米位移臺沿x軸(假設(shè)x方向為快軸)正方向每移動一步，并停留在此位置時，光譜儀馬上對該點的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集并保存．納米位移臺繼續(xù)沿著x方向移動至下一個采樣點，光譜儀再次完成數(shù)據(jù)采集，直至x方向上所有采樣點數(shù)據(jù)采集完畢．然后，納米位移臺沿y軸(假設(shè)y方向為慢軸)移動一步并采集該位置的光譜強度數(shù)據(jù)，隨后，納米位移臺沿x軸負(fù)方向逐步移動并記錄每一位置處的光譜強度信息，依次循環(huán)直至完成整個樣品掃描和數(shù)據(jù)采集．樣品二維點掃描示意如圖3．其中藍(lán)點代表每1個位移臺駐留的每個位置；紅色虛線的箭頭方向代表位移臺的運動方向．按照上述掃描方式完成x-y平面的二維圖像掃描后，如需完成三維空間層析成像，納米位移臺沿z軸方向每運動1步，就在此面上掃描完成1幅x-y平面的二維二維圖像，直至掃描完成像區(qū)域的整個三維空間．CARS顯微成像系統(tǒng)可以獲得任意維度的二維圖像及三維層析圖像[26-27]．

掃描過程中，納米位移臺每移動1步，光譜儀需要記錄1次光譜數(shù)據(jù)，兩者之間的聯(lián)動決定了掃描過程能否完成．本研究根據(jù)廠家提供的開發(fā)包編寫了基于LabView虛擬儀器開發(fā)軟件，實現(xiàn)了納米位移臺與光譜儀的自動控制，使兩臺獨立運行的儀器配合成一個整體實現(xiàn)自動掃描．當(dāng)納米位移臺配合光譜儀完成一定空間范圍內(nèi)樣品的自動掃描后，每個采樣點的位置數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)將形成1個二維數(shù)組并存放于相同的路徑中，掃描過程記錄了每個采樣點的位置數(shù)據(jù)以及光譜數(shù)據(jù)．圖像重構(gòu)過程是一個卷積過程，即將具有一定空間結(jié)構(gòu)的樣品上的每個采樣點均以愛里斑來代替，而每個點采集的光譜數(shù)據(jù)做歸一化處理后對應(yīng)為灰度值．每個采樣位置點的光譜強度值作為整個愛里斑覆蓋區(qū)域(以圖3中虛線框范圍表示)平均強度．采用Matlab軟件編寫了成像代碼，依次打開指定路徑下保存的位置數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)文件，讀取每個采樣點的位置和光譜數(shù)據(jù)，可重構(gòu)具有一定灰度等級的CARS顯微圖像．

基于以上CARS顯微成像系統(tǒng)的搭建及控制程序、圖像重構(gòu)程序的編寫，針對聚苯乙烯分子1 603cm-1的拉曼峰，采用泵浦光與斯托克斯光功率分別為2.3和0.5mW，完成直徑為1.37和4.60μm的聚苯乙烯微球的CARS顯微成像，結(jié)果如圖4．其中，圖4(a)為直徑1.37μm的聚苯乙烯微球的CARS顯微圖像，掃描的單步步長為50nm，步數(shù)為70×70，幅面尺寸為3.5μm×3.5μm，成像耗時約12min；圖5(b)為直徑4.60μm聚苯乙烯微球的CARS顯微圖像，掃描步長為0.2μm，掃描步數(shù)為100×100，幅面尺寸為20μm×20μm成像耗時約25min．

圖4 直徑分別為1.37和4.60 μm的聚苯乙烯微球CARS顯微圖像Fig.4 CARS images of polystyrene microballs with diameters of 1.37 and 4.60 μm respectively

3 CARS顯微成像系統(tǒng)空間分辨率

CARS屬于3階非線性過程，信號強度與激發(fā)光強度呈正比，且只產(chǎn)生于光功率密度較高的焦點處．通過掃描一個尺寸遠(yuǎn)小于光波波長的聚苯乙烯微球，根據(jù)掃描過程記錄的每個采樣點的位置數(shù)據(jù)、光譜數(shù)據(jù)重構(gòu)系統(tǒng)的點擴(kuò)展函數(shù)，及該函數(shù)的半高全寬，得到CARS顯微成像系統(tǒng)的分辨率．實驗中泵浦光中心波長為724nm，斯托克斯光中心波長為820nm，兩者頻差滿足聚苯乙烯分子1 603cm-1的振動頻率，平均功率分別為1.5與7.5mW．

為重構(gòu)系統(tǒng)點擴(kuò)展函數(shù)，選擇尺寸遠(yuǎn)小于光波長的110nm且單獨分布的聚苯乙烯微球進(jìn)行成像．110nm遠(yuǎn)小于光學(xué)顯微鏡的分辨率，目鏡下肉眼很難觀察到此微球分布狀態(tài)，因此，實驗過程中首先通過大步長粗略掃描，采用圖像重構(gòu)方法得到一幅較大范圍內(nèi)微球排布狀況的CARS顯微圖像，然后根據(jù)此圖像選擇掃描起始位置和范圍，確定物鏡聚焦的位置是否需要調(diào)整．此外，為盡可能獲得呈單獨分布的微球，避免大量微球堆聚現(xiàn)象，樣品制備過程中需使少量微球平鋪到載玻片表面．在載玻片表面滴入純水，將聚苯乙烯球樣品滴到水面，依靠液體表面張力使微球呈單層分布，待水自然風(fēng)干后，聚苯乙烯球?qū)①N在載玻片表面．

通過大步長粗略掃描可確定掃描的起始位置以及范圍．納米位移臺移動步長為50nm，光纖光譜儀單點積分時間為100ms．對目標(biāo)樣品進(jìn)行x-y二維方向掃描，完成步長為50nm，幅面步數(shù)為50×50，幅面尺寸為2.5μm×2.5μm的二維空間x-y范圍的CARS顯微圖像掃描．圖5(a)為用Matlab軟件重構(gòu)后獲得的直徑為110nm聚苯乙烯微球的CARS圖像，圖5(b)為經(jīng)高斯擬合后的系統(tǒng)點擴(kuò)展函數(shù)，其半高全寬約為484nm．

圖5 110 nm聚苯乙烯微球的x-y平面CARS顯微圖像及高斯擬合后的x-y平面點擴(kuò)展函數(shù)Fig.5 The x-y dimensional CARS microscopic images of the 110 nm polystyrene balls and point spread function of the CARS system in x-y plane via Gaussian fitting

根據(jù)110nm微球的二維顯微圖像，確定該球在x-y空間的中心位置后，進(jìn)行x-z方向的逐點掃描，則可獲得顯微系統(tǒng)的軸向空間分辨率．掃描過程中，以x軸為快軸，z軸為慢軸，完成二維空間x-z范圍的CARS顯微圖像掃描．圖6(a)為重構(gòu)獲得的110nm聚苯乙烯微球x-z方向的CARS顯微圖像，圖6(b)為經(jīng)高斯擬合后的的系統(tǒng)點擴(kuò)展函數(shù)，其半高全寬約為3.17μm．

圖6 110 nm聚苯乙烯微球的x-z平面CARS顯微圖像及高擬合后的x-z平面點擴(kuò)展函數(shù)Fig.6 The x-z dimensional CARS microscopic images of the 110 nm polystyrene balls and point spread function of the CARS system in x-z plane via Gaussian fitting

本研究搭建的CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向和軸向空間分辨率均高于由阿貝衍射極限決定的理論空間分辨率．橫向空間分辨率下降是由于周圍環(huán)境空氣流動及光學(xué)平臺振動等原因?qū)е碌膼劾锇咂?，?jīng)測試得到成像時間內(nèi)愛里斑相對運動在x和y方向的標(biāo)準(zhǔn)差分別為σx=94 nm和σy=286 nm．軸向空間分辨率下降則主要是由于泵浦光和斯托克斯光發(fā)散角不同及中心波長為820 nm的斯托克斯光經(jīng)過OPO的倍頻晶體后像散嚴(yán)重所致．為提高CARS顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率，可采取以下措施：① 將系統(tǒng)與周圍環(huán)境隔離，更換具有主動隔振功能的光學(xué)平臺，盡量降低愛里斑的相對運動，提高橫向空間分辨率；② 為提高軸向空間分辨率，測試并控制兩束激發(fā)光的發(fā)散角，使其盡可能接近，并在飛秒激光脈沖泵浦OPO前先將其分光，一束泵浦OPO，一束直接作為斯托克斯光，不再采用尚未耗盡的820 nm激光脈沖作為斯托克斯光來降低像散；③ 根據(jù)激發(fā)光波長定制消色差顯微物鏡，提高CARS顯微成像系統(tǒng)空間分辨率．

結(jié) 語

CARS顯微成像技術(shù)可在無需標(biāo)記前提下獲取樣品分子某一特征振動模式的空間分布信息．通過逐點掃描的方法獲得成像物體上每一點的光譜數(shù)據(jù)和相應(yīng)的空間位置信息，每一點的光譜數(shù)據(jù)對應(yīng)一個txt文件，將其映射為灰度值，通過Matlab軟件重構(gòu)獲得樣品的偽彩色圖像．空間分辨率是衡量CARS顯微成像系統(tǒng)性能的一個重要指標(biāo)，本研究通過三維掃描一個直徑遠(yuǎn)小于入射光波長的聚苯乙烯微球，得到CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向和軸向空間分辨率．結(jié)果表明，CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向和軸向空間分辨率均高于由阿貝衍射極限所決定的理論空間分辨率．橫向空間分辨率下降是由于周圍環(huán)境空氣流動以及光學(xué)平臺振動等因素導(dǎo)致的愛里斑漂移，軸向空間分辨率下降主要是由于泵浦光和斯托克斯光發(fā)散角不同，以及斯托克斯的像散所致．以后將針對以上幾點進(jìn)行改進(jìn)，以期提高CARS系統(tǒng)的空間分辨率．

致謝：衷心感謝屈軍樂教授的悉心指導(dǎo)!

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【中文責(zé)編：英 子；英文責(zé)編：木 南】

2016-12-21；Accepted：2017-02-11

Associate professor Chen Danni．E-mail: dannyc007@163.com

Three-dimensional spatial resolution calibration of the coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy

Liu Wei, Liu Shuanglong, Chen Danni, and Niu Hanben

College of Optoelectronic Engineering, Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

The spatial resolution is one of the most important indices for measuring the performance of coherent anti-stokes Raman scattering (CARS) microscopy system. Accordingly, we acquire the three dimensional images of the polystyrene micro-balls with 110 nm diameter in order to reconstruct the point spread function of the system onx-yandx-zplanesbasedonthetwodimensionalarrayconsistingofpositiondataofeachpointandspectraldata.TheresultsshowthatlateralandaxialspatialresolutionsofthehomemadeCARSmicroscopyareabout484nmand3.17μm,respectively.

optical engineering; coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy；imaging reconstruction; point spread function；resolution; nonlinear optics; Raman scattering; information optics

：Liu Wei, Liu Shuanglong, Chen Danni, et al．Three-dimensional spatial resolution calibration of the coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(3): 272-277.(in Chinese)

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項資助項目(2012YQ 15009203)

劉 偉(1980—)，女，深圳大學(xué)博士后研究人員．研究方向：非線性光學(xué)．E-mail：liuwei616029@163.com

Q631；O

A

10.3724/SP.J.1249.2017.03272

Foundation：The Special Funds of the Major Scientific Instruments Equipment Development of China (2012YQ15009203)

引 文：劉 偉，劉雙龍，陳丹妮，等．CARS顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率標(biāo)定[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2017，34(3)：272-277.